腺病毒介導(dǎo)的AIF及其突變體對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

代安亞，王 方，馮文莉

(重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 臨床血液學(xué)教研室 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

?

研究論文

腺病毒介導(dǎo)的AIF及其突變體對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

代安亞，王 方，馮文莉*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 臨床血液學(xué)教研室 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

目的構(gòu)建凋亡誘導(dǎo)因子(Ad-AIF)及其突變體的重組腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF)，觀察其對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響。方法擴(kuò)增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段，分別克隆至pAd-Track-CMV-HA質(zhì)粒中，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，分別與pAd-Easy1質(zhì)粒重組得到腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)包裝和擴(kuò)增后得到腺病毒，以無(wú)外源序列的腺病毒作為空載腺病毒。Western blot驗(yàn)證重組腺病毒在K562細(xì)胞中的表達(dá)，免疫共沉淀檢測(cè)AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70相結(jié)合，Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果重組腺病毒構(gòu)建成功，能夠在K562 細(xì)胞中表達(dá)；AIF和DMLS-AIF與HSP70相結(jié)合，DHBD-AIF不結(jié)合HSP70； Ad-DHBD-AIF引起K562細(xì)胞染色質(zhì)凝集，而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF處理的K562細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻； Ad-DHBD-AIF引起K562細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。 結(jié)論成功構(gòu)建了腺病毒Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，其中Ad-DHBD-AIF對(duì)K562細(xì)胞的凋亡影響明顯高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF，為K562細(xì)胞凋亡受阻的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

凋亡誘導(dǎo)因子；細(xì)胞凋亡；腺病毒載體；K562細(xì)胞

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是以9號(hào)染色體和22號(hào)染色體易位形成BCR-ABL融合蛋白為特點(diǎn)的造血功能紊亂的疾病，其通過(guò)激活多條信號(hào)傳導(dǎo)通路引起細(xì)胞凋亡受阻[1]。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptotic inducing factor, AIF)是參與細(xì)胞非依賴(lài)caspase凋亡途徑的重要因子之一，其基因存在于X染色體上[2- 3]。在細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí)，AIF在線(xiàn)粒體內(nèi)借助其N(xiāo)ADH和FAD結(jié)合區(qū)域參與氧化還原過(guò)程，起傳遞電子的作用；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，AIF從線(xiàn)粒體中釋放，進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，引起染色質(zhì)聚集并將DNA切割成約50 kb的大片段，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2- 5]。在Cos和Rat- 1細(xì)胞中上調(diào)靶向線(xiàn)粒體膜的Bcl- 2蛋白，可延緩AIF異位和核凋亡[6]；AIF進(jìn)入細(xì)胞漿后， HSP70等蛋白與其結(jié)合，使其失去進(jìn)入細(xì)胞核的能力，最終細(xì)胞凋亡受阻[6- 7]，而AIF在凋亡異常的CML細(xì)胞中的作用目前仍不明確，其參與的凋亡過(guò)程是否與HSP70有關(guān)也不清楚，因此構(gòu)建含野生型凋亡誘導(dǎo)因子(Ad-apoptosis-inducing factor，Ad-AIF)、缺線(xiàn)粒體定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)因子突變體(Ad-apoptosis-inducing factor-defected mitochondria localization sign, Ad-DMLS-AIF)和在DMLS-AIF基礎(chǔ)上缺HSP70結(jié)合位點(diǎn)的凋亡誘導(dǎo)因子突變體(Ad-apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF)的重組腺病毒，觀察三者對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響，為研究慢性粒細(xì)胞白血病凋亡異常提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系:腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-Track-cmv-HA及骨架質(zhì)粒pAd-Easy1，E.coliDH5α及E.coliBJ5183，AD293細(xì)胞及K562細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑:RNA提取試劑盒、PrimeScript RT reagent kit、PrimeSTART? HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶 (SalⅠ、NotⅠ)(Takara公司)；限制性?xún)?nèi)切酶PmeⅠ和PacⅠ(NEB公司)；質(zhì)粒提取及純化試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；瓊脂糖膠(Gene公司)；lipofectamineTM2000和Opti-MEM(Invitrogen公司)；鼠抗HA單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體和辣根過(guò)氧化酶-羊抗鼠或羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz公司)；基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑Polybrene和Hoechst33258試劑(Sigma公司)；免疫共沉淀試劑盒(Thermo公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(Cell Signaling公司)；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AD293細(xì)胞，含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細(xì)胞，均在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增:根據(jù)GenBank中人AIF cDNA序列(AF100928)設(shè)計(jì)引物, 由華大基因合成。 AIF上游:5′-ACGCGTCGACATGTTCCGGTGTGG AGGCCTGGCGGCGGGTGC-3′，DMLS-AIF上游:5′-A CGCGTCGACGAGGAAGTTCCTCAAGACAAGGCGC-3′，DHBD-AIF上游：5′-ACGCGTCGACACTGGGAAGAA GGTAGTACAGCTGG-3′，以上三者的共同下游: 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCTTCATGAATGTTGA ATAG-3′(下劃線(xiàn)加粗部位為SalⅠ酶切位點(diǎn)，下劃線(xiàn)部分為NotⅠ酶切位點(diǎn))。提取K562細(xì)胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得AIF片段。PCR反應(yīng)體系為：5×PCR Primer STAR緩沖液10 μL，dNTP混合物4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，DNA聚合酶0.5 μL,補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。DMLS-AIF及DHBD-AIF基因的擴(kuò)增同AIF基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進(jìn)行回收純化。

1.2.3 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建:將AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF基因分別連接到pAd-Track-CMV-HA質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至DH5α,増菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切、PCR鑒定正確后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.4 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建、包裝和擴(kuò)增:將重組穿梭質(zhì)粒與 pAd-Easy1質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化至DH5α中,提取質(zhì)粒,PacⅠ酶切鑒定正確后進(jìn)行腺病毒包裝。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AD293細(xì)胞，按照每孔1×105個(gè)/L細(xì)胞接種于6孔板中。將被PacⅠ酶切線(xiàn)性化的腺病毒質(zhì)粒同轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(腺病毒質(zhì)粒∶lipofectamineTM2000=1∶3)混合，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在12～13 d時(shí)，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)大量帶有GFP綠色熒光的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，在-80 ℃與37 ℃之間，經(jīng)5次冷凍-融化-劇烈振蕩后，離心收集上清液，獲得第一代重組腺病毒，命名為Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，經(jīng)3輪擴(kuò)增后，收集上清液，-80 ℃保存。

1.2.5 Western blot檢測(cè)目的蛋白在白血病K562細(xì)胞中的表達(dá):提取空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF感染24 h后的K562細(xì)胞蛋白和未處理K562細(xì)胞蛋白，進(jìn)行8% SDS-PAGE，4 ℃，含5%脫脂奶粉的TBST封閉過(guò)夜，加入鼠抗HA單克隆抗體和兔抗β-actin單克隆抗體(1∶1000稀釋)4 ℃孵育8 h，TBST洗3次，5 min/次，辣根過(guò)氧化物酶-羊抗鼠IgG抗體或辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次，電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)蛋白的表達(dá)。 1.2.6 免疫共沉淀分析HSP70與AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF之間的關(guān)系:在Ad-AIF感染K562細(xì)胞48 h時(shí)，離心收集細(xì)胞，PBS洗3次，提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)測(cè)其濃度，1 mg蛋白加入HSP70抗體20 μL，裂解/清洗緩沖液補(bǔ)充至300 μL(將此混合液命名為A液)，4 ℃，混勻6 h后，吸取20 μL Pierce A/G Agarose至收集管中，1 000×g離心1 min，100 μL裂解/清洗緩沖液清洗收集管2次，將A液加入至收集管中，4 ℃，混勻1 h后,1 000×g離心1 min，清洗收集管兩次，100 μL 1×條件緩沖液清洗1次，加入50 μL洗脫液，100 ℃煮5 min，4 ℃，13 000×g離心10 min，-80 ℃保存，Ad-DMLS-AIF、Ad-DHBD-AIF及未處理組同Ad-AIF處理，Western blot分析。

1.2.7 Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)觀察重組腺病毒對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響:將空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別在48 h時(shí)收集細(xì)胞，采用Hoechst33258染色檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡；將空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細(xì)胞48 h，同時(shí)將K562細(xì)胞使用泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理后再感染Ad-DHBD-AIF 48 h，分別收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)(送于重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院進(jìn)行檢測(cè)，該單位采用7-ADD和Annexin-PE進(jìn)行標(biāo)記)進(jìn)行K562細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增和鑒定

PCR擴(kuò)增獲得了1 842 bp的AIF片段、1 482 bp的DMLS-AIF片段和1 158 bp的DHBD-AIF片段 (圖1)。

2.2 重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增

包裝重組腺病毒的第8天進(jìn)行GFP熒光采集(圖2)，包裝的原代腺病毒在12天左右收獲。

2.3 目的蛋白在白血病K562細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證

在空載腺病毒、Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細(xì)胞24 h后，可檢測(cè)到各自相應(yīng)蛋白的表達(dá)(圖3)。

2.4 免疫共沉淀分析AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70結(jié)合

AIF和DMLS-AIF與HSP70結(jié)合，而DHBD-AIF不與HSP70結(jié)合(圖4)。

A:amplification products of AIF and DMLS-AIF, M.DL2000(+1 500 bp) DNA marker, 1～3.amplification products of DMLS-AIF, 4～6.amplification products of AIF； B.amplification products of DHBD-AIF; 7～10.amplification products of DHBD-AIF; M.DL2000C+1 500 bp DNA marker

圖1 PCR擴(kuò)增AIF、 DMLS-AIF和DHBD-AIF產(chǎn)物
Fig 1 Amplification products of AIF,DMLS-AIF and DHBD-AIF by PCR

圖2 熒光顯微鏡檢測(cè)在重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AD293細(xì)胞第8天時(shí)GFP熒光蛋白的表達(dá)Fig 2 The expression of GFP protein in AD293 cellsat 8th day transformed with recombinant adeno-virus plasmid was detected through fluore-scence microscope(×100)

2.5 重組腺病毒對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響

Ad-DHBD-AIF處理組的K562細(xì)胞呈凋亡形態(tài)改變，細(xì)胞核變亮，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮呈環(huán)狀或團(tuán)狀或串珠狀，Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF處理組，K562細(xì)胞核染色均勻(圖5)；Ad-DHBD-AIF引起K562細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯高于其他處理組， caspase失活可促進(jìn)Ad-DHBD-AIF引起的細(xì)胞凋亡(圖6)。

圖3 Western blot驗(yàn)證AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF在白血病K562細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3 Identification of AIF, DMLS-AIF and DHBD-AIFexpressing in leukemia K562 cells throughWestern blot

圖4 CO-IP檢測(cè)HSP70與AIF、DMLS-AIF或DHBD-AIF的關(guān)系Fig 4 The relationship between HSP70 and AIF， DMLS-AIF or DHBD-AIF was detected by CO-IP

圖5 Hoechst33258染色評(píng)價(jià)重組腺病毒對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響Fig 5 Apoptotic effect of recombinant adenovirus on leukemia K562 cells analyzed by Hoechst33258 staining(×400)

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病是一種細(xì)胞凋亡受阻的惡性血液性腫瘤，對(duì)新發(fā)的慢性期患者，伊馬替尼治療效果較好，但是隨著治療的進(jìn)行，對(duì)伊馬替尼耐藥和復(fù)發(fā)現(xiàn)象也隨即出現(xiàn)[8- 9]，因此對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡異常的研究尤為重要。由于腫瘤的發(fā)生原因之一是細(xì)胞凋亡受阻，因此再次激活細(xì)胞凋亡成了消除腫瘤的主要目標(biāo)，也是多種血液性腫瘤包括急慢性T淋巴細(xì)胞白血病放化療的目標(biāo)[10]。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)參與非依賴(lài)caspase的凋亡途徑，首先在線(xiàn)粒體中被剪切成為成熟的AIF，當(dāng)線(xiàn)粒體膜通透性增加時(shí)，被釋放進(jìn)入胞質(zhì)，再進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮促凋亡作用。有研究者發(fā)現(xiàn)在Jurkat細(xì)胞中，聯(lián)合維甲酰酚胺和吲哚美辛可誘導(dǎo)AIF入核，使約90%的細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]；在Jurkat細(xì)胞和急性淋巴細(xì)胞白血病病人的細(xì)胞中，鋅螯合劑TPEN通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)氧化氫而引起線(xiàn)粒體膜通透性增加，AIF釋放入核，引起細(xì)胞凋亡[12]。

AIF是細(xì)胞內(nèi)源性蛋白，在caspase失活或者未被激活的情況下才發(fā)揮作用[7]，然而有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用泛caspase抑制劑后，AIF釋放過(guò)程受到影響，不能入核發(fā)揮作用[13]，即使釋放之后，在一些腫瘤細(xì)胞中AIF也被HSP70阻滯在細(xì)胞漿中[14]，不能入核發(fā)揮促凋亡作用。然而CML細(xì)胞凋亡受阻是否與AIF有關(guān)還尚不清楚，因此該研究利用腺病毒具有感染率高, 不受細(xì)胞種類(lèi)及增殖狀態(tài)限制, 無(wú)遺傳毒性, 攜帶外源基因量大以及操作方便等優(yōu)點(diǎn)[15]，構(gòu)建了含野生型凋亡誘導(dǎo)因子、缺線(xiàn)粒體定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)因子突變體和在缺線(xiàn)粒體定位信號(hào)的基礎(chǔ)上再缺HSP70結(jié)合位點(diǎn)的凋亡誘導(dǎo)因子突變體的重組腺病毒，觀察3者對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，其中Ad-DHBD-AIF可引起K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且caspase失活可增強(qiáng)其促凋亡作用，而與HSP70結(jié)合的Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF對(duì) K562細(xì)胞凋亡的影響與空載腺病毒組類(lèi)似， 因此K562細(xì)胞凋亡異常與AIF結(jié)合HSP70有密切關(guān)系，這為慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡異常的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

*P<0.05 compared with empty vector; #P<0.05 compared with Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組腺病毒對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響Fig 6 Effect of recombinant adenovirus on the apoptosis of K562 cells analyzed by flow cytometry

[1] Chen X, Shi XP, Zhao C,etal. Anti-rheumatic agent auranofin induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells resistant to imatinib through both Bcr/ Abl-dependent and -independent mechanisms [J]. Oncotarget,2014, 5: 9118- 9132.

[2] Sevrioukova IF. Apoptosis-Inducing Factor: Structure, Function, and Redox Regulation[J]. Antioxid Redox Signal,2011,14:2545- 2579.

[3] Modjtahedi N, Giordanetto F, Madeo F,etal. Apoptosis-inducing factor: vital and lethal[J]. Trends Cell Biol,2006,16:264- 272.

[4] Delavalle L, Cabon L, Galan-Malo P,etal.AIF-mediated Caspase-independent Necroptosis: A New Chance for Targeted Therapeutics[J].IUBMB Life,2011,63: 221- 232.

[5] Ding ZJ, Chen X, Tang XX,etal. Calpain inhibitor PD150606 attenuates glutamate induced spiral ganglion neuron apoptosis through apoptosis inducing factor pathwayinvitro[J]. PLoS One,2015,10:e0123130-e0123140.doi: 10.1371/journal.pone.0123130.

[6] Loeffler M, Daugas E,Susin SA,etal. Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosis-inducing factor[J]. FASEB J,2001,15:758- 767.

[7] Han B, Wang TD, Shen SM,etal. Annonaceous acetogenin mimic AA005 induces cancer cell death via apoptosis inducing factor through a caspase- 3-independent mechanism [J]. BMC Cancer,2015,15:139- 150.

[8] Chen X, Shi XP, Wang XJ,etal. Novel use of old drug: Anti-rheumatic agent auranofin overcomes imatinib-resistance of chronic myeloid leukemia cells[J]. Cancer Cell Microenviron,2014, 1:e415- 422.doi: 10.14800/ccm.415.

[9] Reavie L,Buckley SM, Loizou E,etal. Regulation of c-Myc Ubiquitination Controls Chronic Myelogenous Leukemia Initiation and Progression[J].Cancer Cell,2013,23:362- 375.

[10] Mendivil-Perez M, Jimenez-Del-Rio M, Velez-Pardo C. Glucose starvation induces apoptosis in a model of acute T leukemia dependent on caspase- 3 and apoptosis-inducing factor: a therapeutic strategy[J]. Nutr Cancer,2013,65: 99- 109.

[11] Hojka-Osinska A, Ziolo E, Rapak A. Combined treatment with fenretinide and indomethacin induces AIF-mediated, non-classical cell death in human acute T-cell leukemia Jurkat cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,419: 590- 595.

[12] Mendivil-Perez M, elez-Pardo C, Jimenez-Del-Rio M. TPEN induces apoptosis nindependently of zinc chelator activity in a model of acute lymphoblastic leukemia and ex vivo acute leukemia cells through oxidative stress and mitochondria caspase- 3-and AIF-dependent pathways[J]. Oxid Med Cell Longev,2012: 313275- 313289.

[13] Arnoult D, Parone P, Martinou JC,etal. Mitochondrial release of apoptosis-inducing factor occurs downstream of cytochrome c release in response to several proapoptotic stimuli[J].J Cell Biol, 2002,159:923- 929.

[14] Zhu Q, Xu YM, Wang LF,etal.Heat shock protein 70 silencing enhances apoptosis inducing factor-mediated cell death in hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J].Cancer Biol Ther,2009,8: 792- 798.

[15] 李千音,黃崢蘭,高淼,等.重組腺病毒Ad5 / F35-HF2S 的構(gòu)建及其鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2012,25:1434- 1438.

Effect of adenovirus-mediatedAIF and its mutants on the apoptosis of K562 cells

DAI An-ya, WANG Fang, FENG Wen-li*

(Dept. of Clinical Hematology，Key Laboratory of Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

Objective To construct the recombinant adenovirus Ad-AIF, Ad-DMLS-AIF and Ad-DHBD-AIF and to detect their apoptotic effect on leukemia K562 cells. Methods AIF gene and its mutants(DMLS-AIF gene and DHBD-AIF gene)were amplified and cloned into the shuttle plasmid pAd-Track-CMV-HA, after identification by PCR, double-enzyme digestion and sequencing, recombined homology with pAdEasy1 to obtain recombinant adenovirus plasmid and then were packaged and amplified, adenovirus without exogenous sequence as empty vector. Western blot was used to analyze expression of the recombinant adenovirus in K562 cells; Co-immunoprecipitation assay (CO-IP) was applied to detect the relationship between HSP70 and AIF or DMLS-AIF or DHBD-AIF; Hoechst33258 dye and FCM were applied to detect the apoptotic effect of the recombinant adenovirus on K562 cells. Results The recombinant adenovirus was successfully constructed and expressed in K562 cells; AIF and DMLS-AIF were connected to HSP70 except DHBD-AIF; the chromatin was agglutinated in K562 cells infected with Ad-DHBD-AIF, that were uniformity in K562 cells infected with Ad-AIF or Ad-DMLS-AIF; the apoptotic efficacy of Ad-DHBD-AIF on K562 cells was better than that of Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF. Conclusions Ad-AIF, Ad-DMLS-AIF and Ad-DHBD-AIF were constructed successfully, the apoptotic effect of Ad-DHBD-AIF on K562 cells was higher significantly comparing with that of Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF, which may support to explore the anti-apoptosis mechanisms in K562 cells.

apoptosis-inducing factor；cell apoptosis；recombinant adenovirus；K562 cells

2015- 05- 18

2015- 07- 03

國(guó)家自然科學(xué)基金(81070421)

1001-6325(2015)11-1453-07

R733.3

A

*通信作者(corresponding author)：fengwlcqmu@sina.com