重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK的構建和體內、外抑殺瘤作用的實驗研究

高云東 李晶玉 劉進 尹桂華 宋玉國 王翠霞

重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK的構建和體內、外抑殺瘤作用的實驗研究

高云東 李晶玉 劉進 尹桂華 宋玉國 王翠霞

目的 構建重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK，并研究其在體內、體外殺瘤作用的應用。方法 選取2011年2月～2013年12月北華大學附屬醫(yī)院收治的卵巢癌患者100例，隨機均分為治療組與對照組（n=50），治療組采取患者的癌癥細胞SKOV3細胞，將病毒質粒經介質傳染給癌癥細胞并進行PCR體外擴增，經紫外線分光光度法檢測病毒顆粒濃度，以TCID50法檢測感染性滴度，并計算病毒比活性，保證植入的病毒含有E1A基因片段；對照組患者進行體內植入重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK，觀察抑制殺瘤療效。結果 經PCR體外擴增，得到DNA片段，進行凝膠電泳，可知植入的重組溶瘤腺病毒含有E1A基因片段。通過紫外線分光光度法測得治療組病毒顆粒濃度比上測得的感染性滴度得到病毒比活性為3.56%，顯著高于對照組2.01%（P＜0.05）。進行體外抑瘤實驗中，治療組注入病毒成分為rAd-E1A-CDglyTK，其對SKOV3細胞的生長抑制率為（16.59±1.57），顯著高于含有rAd-CDglyTK的對照組生長抑制率（10.80±1.47）（P＜0.05）。體內抑瘤實驗中，治療組生長抑制率為（26.12±8.11），顯著高于對照組（1.69±4.12），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論 重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有較好的抑制殺瘤作用，其中體內殺瘤強于體外殺瘤，療效顯著，值得推廣使用。

重組溶瘤腺病毒；rAd-E1A-CDglyTK；體內；體外

腺病毒是一類DNA病毒，人體共有約50余種腺病毒，該病毒對人體沒有致癌性，長度約為20～40個堿基對[1]。腫瘤由腫瘤細胞構成，形態(tài)大小不一，危害程度不等，分為良性腫瘤與惡性腫瘤，為臨床上常發(fā)疾病之一，漸漸成為困擾人們生活健康的罪魁禍首，受到醫(yī)學界的高度重視[2]。而溶瘤腺病毒是一種具有復制能力并且能夠抑制殺害腫瘤的殺傷性病毒，目前，通過運用溶瘤腺病毒的方式消滅腫瘤在醫(yī)學上較為常見，其理論與實踐技術也逐漸成熟[3]。本研究分析100例患者臨床資料，探討重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK在體內、體外殺瘤作用的應用療效與價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年2月～2013年12月北華大學附屬醫(yī)院收治的卵巢癌患者100例，保證患者具有大致相同既往病史,隨機均分為治療組與對照組（n=50）。其中治療組中男27例，女23例，年齡44～65歲，平均年齡（54.5±5.5）歲；對照組中男24例，女26例，年齡46～63歲，平均年齡（54.5±5.5）歲。2組患者在年齡、病史等一般資料方面差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器 本次實驗的儀器包括PCR儀器由長春博研科學儀器有限責任公司提供；凝膠電泳儀器由長春博訊提供；分光光度紫外線儀器與TCID檢測儀由長春博訊提供。高度離心機由長春博研科學儀器有限責任公司提供。冷凍離心機、高速冷凍離心機、超速冷凍離心機由北京科學儀器有限責任公司提供。電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光顯微鏡成像系統(tǒng)由上海儀器有限責任公司提供。

1.2.2 實驗方法 （1）PCR擴增：聚合酶鏈反應，1個周期由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成。其中退火溫度控制在70℃左右，標準反應體系操作，即包含緩沖劑Mg2+1.5mmol/L，模板DNA 0.1～2μg，引物各10～100pmol，4種dNTP混合物各200μmol/L及10×擴增緩沖液10μL。其中PCR弓I物：由Takara公司合成。

E1A上游引物：5’-GAAGATCTTAGAGTTTTCTCCTC CG-3’

E1A下游引物：5’-AGGGAGAGGGGCGGAATTGGCCG CCCTCACACACGCAATCACAGGTnACACC-3’

CDglyTK上游引物：5’-CCGCTCGAGAGGCTAACAAT GTCGAAT-3’

CDglyTK下游引物：5’-GCTCTAGATCAGTTAGCCTC CCCCATCT-3’

（2）紫外線分光光度法：取待測液裝入干凈的1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率。

（3）TCID50測定。

（4）凝膠成像，熒光成像。

1.3 觀察指標 （1）根據PCR進行DNA重組擴增，凝膠電泳成像觀察，與可知物對比，得到待測物所含基因片段。（2)通過分光光度法，朗伯比爾定律，當單色輻射照射到吸收層厚度為b，濃度為c的吸光物質時，輻射能的吸收依賴于該物質的濃度與吸收層的厚度。測得待測物基因片段。（3)病毒比活性為病毒顆粒濃度與感染性濃度的比值，反映病毒中含酶制劑的純度。（4）生長抑制率指對其生長抑制的能力，同未包含rAd-E1A-CDglyTK病毒的對照組相比對SKOV3腫瘤細胞的生長抑制率。

1.4 統(tǒng)計學方法 對本組研究的數(shù)據采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)計量資料采用“x±s”表示，2組正態(tài)計量數(shù)據的組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組病毒比活性比較 2組患者經紫外線分光光度法與TCID50測定后，可計算病毒比活。含有rAd-E1ACDglyTK的治療組病毒比活為3.34%，顯著高于含有rAd-CDglyTK的對照組（2.01%），治療組病毒具有較高酶純度。2組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 患者的CMI得分比較（%）

2.2 患者對SKOV3細胞的生長抑制率比較 經比較分析后，無論體內抑制還是體外抑制，治療組生長抑制率均顯著高于對照組。2組數(shù)據比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

腫瘤是臨床上常見的疾病之一，大小不一，發(fā)病原因與位置同樣不可確定，腫瘤分為良性腫瘤與惡心腫瘤，隨著時代的發(fā)展、醫(yī)學的進步，對腫瘤的治療已不僅局限于簡單的用藥治療與外科手術治療[4]，通過溶瘤病毒抑制殺害腫瘤的方式已逐漸成熟并效果顯著[5]。腺病毒在人體內含量較多，且無致病性，因此可用于溶瘤病毒的重組[6]。其中，我國應用重組溶瘤腺病毒的方式來抑制殺害腫瘤興起于20世紀90年代，隨著科技的進步，我國對該種治療方式的研究小有成效。此外，國內外學者對重組溶瘤腺病毒及腫瘤治療的研究也逐漸發(fā)展與成熟。對于腫瘤患者的治療不能僅依靠醫(yī)生的精湛技藝以及高端儀器的先進技術，同時需要研發(fā)高效、無害、簡易方便的溶瘤病毒技術[7-8]。經本實驗可知，通過PCR擴增及分光光度法可測得在經PCR體外擴增，得到DNA片段，進行凝膠電泳，可知植入的重組溶瘤腺病毒含有E1A基因片段。同時通過紫外線分光光度法測得治療組病毒顆粒濃度比上測得的感染性滴度得到病毒比活性為3.56%，顯著高于對照組2.01%（P＜0.05），表明重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有更高純度的酶制劑，其活性更強。在體外體內抑制腫瘤實驗中，治療組中對SKOV3腫瘤細胞的生長抑制率分別為（16.59±1.57）%與（26.12±8.11）%，顯著高于對照組[（10.80±1.47）%與（1.69±4.12）%](P＜0.05)，表明重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK對于腫瘤的抑制殺害具有較好的療效。

表2 2組患者的腫瘤抑制率比較（x±s）

綜上所述，重組溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK具有較好的抑制殺瘤作用，其中體內殺瘤強于體外殺瘤，療效顯著，值得廣泛應用及推廣。

[1] 付成偉，王洛夫，江軍，等.rPB-DR（6）調控的溶瘤腺病毒對前列腺癌細胞的殺傷作用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2013，35（24）：2659-2664.

[2] 孫立臣.雙靶向溶瘤腺病毒攜帶內皮抑素基因對肝癌的抑制作用[J].中華實驗外科雜志，2012，29（8）：1529-1531．

[3] 文博，李曉銘，徐麗娟，等.PTEN增強溶瘤腺病毒對前列腺癌細胞的特異性殺傷作用[J].華中科技大學學報（醫(yī)學版），2011，40（4）：429，454.

[4] 岳學田，張立堂，王毅剛，等.新型結腸癌個性化治療重組溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13的構建[J].浙江理工大學學報，2009，26（4）：567-570.

[5] 陳波，史振鐸，邱祥政，等.雙調控溶瘤腺病毒對膀胱腫瘤EJ細胞的殺傷作用[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2014，33（1）：9-11.

[6] 孫立臣，張柏和，張琪，等.新型增殖型腺病毒CNHK500-h1對肝癌細胞的殺傷作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，201l，18（6）：635-640．[7] 肖斌，杜亦奇，滿小華，等.基因重組溶瘤腺病毒與無水乙醇瘤內注射聯(lián)合化療治療胰腺癌的對比實驗研究[J].中華消化內鏡雜志，2013，30（6）:8854-8855.

[8] 張躍偉，娜仁圖弋，李闖，等.內鏡下rAd-p53注射聯(lián)合動脈灌注治療進展期胃癌[J].當代醫(yī)學，2010,16(11)：552-553.

Objective To build recombinant adenovirus soluble tumor rAd-E1A-CDglyTK, and to study the application of the in vivo and in vitro killing tumor effect. Methods 100 cases of patients with ovarian cancer randomly divided into the treatment group and the control group, 50 cases in each group, the treatment group was taken the patient's cancer cell SKOV3 cell, the virus plasmid by the medium transmission to cancer cells in vitro and PCR amplification, the ultraviolet spectrophotometry to detect virus particles concentration, degree of TCID50 method in detecting infectious droplets, and calculate the virus than activity, to ensure the implant virus contains E1A gene fragment, the control group patients were implanted with recombinant adenovirus rAd - soluble tumor E1A - CDglyTK, to observe inhibiting tumor response. Results To get DNA fragments by PCR amplification in vitro, it was implanted recombinant adenovirus containing soluble tumor E1A gene fragment for gel electrophoresis. The degree of infectious droplets get virus activity of the treatment group virus particles concentration ratio by ultraviolet spectrophotometry measured(3.56%) was higher than the control group(2.01%). The treatment group was injected the virus components in rAd - E1A - CDglyTK in vitro tumor suppression experiments, the SKOV3 cells growth inhibition rate (16.59±1.57) was significantly higher than the control group containing rAd-CDglyTK growth inhibition rate (10.80±1.47). The treatment group growth inhibition rate (26.12±8.11) was high than the control group (1.69±4.12) in vivo tumor suppression experiments, the difference had statistically significant (P＜0.05). Conclusion Recombinant adenovirus rAd - soluble tumor E1A-CDglyTK has good inhibitory effect of killing tumor, killing tumor in the body is stronger than killing tumor in vitro, the curative effect is distinct, it should use to be promoted.

Recombinant adenovirus soluble tumor; RAd-E1A-CDglyTK; In the body; In vitro

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.9.008

吉林 132011 北華大學附屬醫(yī)院腫瘤科 （高云東 王翠霞）北華大學附屬醫(yī)院神經內科 （李晶玉） 北華大學附屬醫(yī)院科研辦公室 （劉進） 北華大學附屬醫(yī)院藥劑科 （尹桂華） 北華大學附屬醫(yī)院免疫研究室（宋玉國）