三種染色方法檢測(cè)凍融后兔卵巢組織的活力和質(zhì)量

劉麗英 曲文玉 孔剛 張曉麗 劉曉麗

三種染色方法檢測(cè)凍融后兔卵巢組織的活力和質(zhì)量

劉麗英 曲文玉 孔剛 張曉麗 劉曉麗

目的 建立一種簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)冷凍前后卵巢組織活力與質(zhì)量的方法。方法 10只性成熟雌性大耳白兔，取卵巢組織制成皮質(zhì)片，隨機(jī)均分成2組（n=5）：新鮮組織和冷凍組織。臺(tái)盼藍(lán)、Calcein AM/EH及中性紅染色檢測(cè)分離卵泡的存活率并對(duì)卵巢組織中卵泡的存活情況進(jìn)行染色。激素釋放試驗(yàn)檢測(cè)冷凍前后兔卵巢組織的功能。結(jié)果 應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)、Calcein AM/EH及中性紅對(duì)卵巢組織分離卵泡活力的評(píng)價(jià)效果相似；中性紅能較好的評(píng)價(jià)卵巢組織中卵泡的存活情況。經(jīng)冷凍解凍后，卵泡的活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；體外培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液E2水平不斷增加，培養(yǎng)12d后，E2濃度在新鮮及冷凍復(fù)蘇組織分別達(dá)1054、961pg/mL。孕酮水平分別為2.31、1.9ng/mL。結(jié)論 中性紅可有效地評(píng)價(jià)卵巢組織卵泡的活性；激素釋放試驗(yàn)可以提供冷凍解凍卵巢組織存在活性的佐證。

冷凍保存；卵巢組織；臺(tái)盼藍(lán)；中性紅

卵巢是女性的性腺，其主要功能有：產(chǎn)生卵子并排卵的生殖功能及產(chǎn)生性激素的內(nèi)分泌功能。自然情況下，隨著年齡的增長(zhǎng)，女性生殖能力逐漸下降是正常的、不可避免的。但對(duì)于患惡性腫瘤的女性患者(尤其是兒童和青春期前)來(lái)講，抗腫瘤治療：如大劑量化療和放療、婦科根治性手術(shù)治療(切除性腺)等都會(huì)對(duì)部分性腺功能產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，甚至是喪失，對(duì)患者的生活質(zhì)量和生殖能力造成嚴(yán)重的影響。目前已經(jīng)出現(xiàn)多種保存女性生育力的方法：一些團(tuán)隊(duì)試圖富集卵子進(jìn)行冷凍保存[1]，而其他一些團(tuán)隊(duì)則在卵巢冷凍方面進(jìn)行研究[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大鼠、小鼠及家兔的卵巢組織經(jīng)冷凍、解凍及自體移植能夠獲得妊娠[3-4]。同時(shí)卵巢的冷凍及自體移植還能夠恢復(fù)患者的內(nèi)分泌功能。

冷凍卵巢組織結(jié)構(gòu)的完整性及卵泡活力的評(píng)價(jià)方法有：組織學(xué)評(píng)價(jià)（光鏡及電鏡）及活細(xì)胞染色。卵巢組織功能的評(píng)價(jià)方法有激素釋放試驗(yàn)及卵巢組織的移植試驗(yàn)。本研究的目的在于應(yīng)用上述方法對(duì)兔的卵巢組織進(jìn)行冷凍前后的評(píng)價(jià)，以為人類的卵巢組織冷凍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢組織皮質(zhì)片的制備 4～5個(gè)月齡清潔級(jí)性成熟雌性大耳白兔10只，體質(zhì)量2～2.5kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。經(jīng)兔耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉溶液(2mL/kg)。麻醉動(dòng)物后行下腹正中切口，切取卵巢組織。去除卵巢組織周圍的脂肪組織、系膜以及血漬，室溫下采用PBS液反復(fù)沖洗。用刀片切除髓質(zhì)部分，僅保留卵巢皮質(zhì)，切割成1mm×5mm×5mm大小的組織塊，整個(gè)切割過(guò)程15min內(nèi)完成，將組織分為新鮮組織（對(duì)照組）和冷凍組織（實(shí)驗(yàn)組）。

1.2 卵巢組織的冷凍與解凍 卵巢組織塊裝入含6mL的卵巢冷凍液中（含10%胎牛血清、1.5mol/L乙二醇,PBS），4℃搖床平衡30min，裝入1.8mL的細(xì)胞凍存管，置于Planner程序降溫儀中。－2℃～－9℃，2℃/min，－9℃～－40℃，0.3℃/ min，－40℃～－140℃，－10℃/min，－9℃植冰，冷凍曲線保存于計(jì)算機(jī)中，凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存。

解凍：37℃解凍，依次經(jīng)過(guò)解凍液1、2、3（解凍液1含0.75M EG，0.25M S，PBS，10%胎牛血清；解凍液2含0.25M S，PSB，10%胎牛血清；解凍液3含PBS，10%胎牛血清）各10min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護(hù)劑。

1.3 卵泡的分離及染色

1.3.1 卵泡的分離 將新鮮及冷凍解凍的卵巢組織移到Mcllwain切片機(jī)墊板上，切至卵巢組織大小約為0.5mm×0.5mm ×0.5mm。將切碎的卵巢組織移至含Liberase blendzyme（終濃度為0.04mg／mL）的50mL離心管中，37℃水浴中輕微震蕩60min，每10min用巴氏吸管輕輕吹打，胎牛血清終止消化反應(yīng)。懸濁液500轉(zhuǎn)，4℃離心10min，去上清，將沉渣轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，體式顯微鏡下觀察卵泡。用130μm內(nèi)徑的巴氏吸管將卵泡一個(gè)接一個(gè)吸出來(lái)，放在盛有含10%胎牛血清(FBS)的PBS的培養(yǎng)皿中，洗滌3次，將肉眼所見(jiàn)的間質(zhì)細(xì)胞全部去除。

1.3.2 臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn) 卵泡應(yīng)用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色約1min。倒置顯微鏡下觀察（×400倍），卵泡中≥10%的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞藍(lán)染為異常卵泡。卵母細(xì)胞不著色且僅＜10%的顆粒細(xì)胞著色表示為正常卵泡。

1.3.3 Calcein AM/Ethidium homodimer-1染色 在培養(yǎng)液滴中加入等體積的2×Calcein AM/Ethidium Homodimer-1工作液混勻，37℃避光染色45min，熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為（495/515nm）和（495/635nm）），觀察存活卵泡(綠色熒光)和死亡卵泡(紅色熒光)，計(jì)算存活卵泡的百分比。

1.3.4 中性紅染色 卵泡應(yīng)用15μg/mL的中性紅染色，倒置顯微鏡下觀察（×400倍），卵泡中卵母細(xì)胞及＞90%顆粒細(xì)胞著色的為存活卵泡。

1.4 卵巢組織中卵泡活性的染色 新鮮及冷凍復(fù)蘇的卵巢皮質(zhì)組織用組織切片機(jī)切割，將卵巢組織移到Mcllwain切片機(jī)墊板上，將卵巢組織切至泥狀，分別應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)、Calcein AM/ EH及中性紅進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察。

1.5 激素釋放試驗(yàn) 將冷凍前后的卵巢皮質(zhì)片轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL卵泡培養(yǎng)液[含1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（Its），100mIU/mL的卵泡刺激素（FSH），10mIU/mL的黃體生成素（LH），5%胎牛血清（FCS）的α-MEM]的35mm培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2培養(yǎng)24h半量換液，收集培養(yǎng)液凍于-80℃冰箱中待用。解凍冷凍保存的培養(yǎng)液，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定雌二醇及孕酮水平。試劑盒購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)羅氏公司，電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)買(mǎi)于瑞士Roche公司，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 冷凍對(duì)卵巢組織內(nèi)分離卵泡的影響 在倒置顯微鏡下觀察，新鮮卵巢組織分離獲得的竇前卵泡大部分呈圓形或卵圓型，有完整的顆粒細(xì)胞層。卵母細(xì)胞位于卵泡的中間或略偏一側(cè)，鏡下表現(xiàn)為圓而明亮，胞質(zhì)均勻；顆粒細(xì)胞層周圍光滑。見(jiàn)圖1A。冷凍復(fù)蘇后的兔卵巢組織經(jīng)分離獲得的部分竇前卵泡與新鮮卵巢組織分離獲得的竇前卵泡形態(tài)相似，部分卵泡表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞層模糊或破損，變形或崩解。卵母細(xì)胞色澤暗淡，模糊不清。見(jiàn)圖1B。

卵泡經(jīng)雙熒光染色后，在藍(lán)光的激發(fā)下，活細(xì)胞顯示綠色熒光，死亡細(xì)胞顯示紅色熒光；卵泡經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，藍(lán)染的為死亡卵泡，不著色的為存活卵泡；卵泡經(jīng)中性紅染色后紅染的為存活卵泡，不著色的為死亡卵泡。見(jiàn)圖2。冷凍前后卵泡存活率的比較見(jiàn)表1。

表1 冷凍前后兔分離卵泡的存活率比較

3種染色方法對(duì)冷凍前后兔卵巢組織分離卵泡的染色結(jié)果提示，臺(tái)盼藍(lán)、Calcein AM/EH與中性紅給出了相似的卵泡存活率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冷凍復(fù)蘇組織的卵泡存活率低于新鮮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可見(jiàn)在冷凍及卵泡分離過(guò)程中受到一定的損傷。

圖1 分離冷凍前后竇前卵泡的形態(tài)

圖2 3種染色方法進(jìn)行分離卵泡的染色結(jié)果

2.2 卵巢組織中卵泡活性的檢測(cè)結(jié)果 卵巢組織中卵泡的染色結(jié)果顯示，臺(tái)盼藍(lán)僅能檢測(cè)死亡卵泡的情況，不能檢測(cè)卵巢組織中存活卵泡的數(shù)量，不利于移植前卵泡狀態(tài)的評(píng)估。Calcein AM/EH不能檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況，中性紅作為活細(xì)胞染料可以很好的檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況，有利于移植前的卵巢組織卵泡狀態(tài)的評(píng)價(jià)。見(jiàn)圖3。

圖3 中性紅檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況

2.3 激素釋放試驗(yàn) 為了排除卵泡培養(yǎng)液內(nèi)存在相關(guān)激素的可能性，對(duì)新鮮的卵泡培養(yǎng)液的激素水平進(jìn)行測(cè)定：17-β雌二醇（E2）＜10pg/mL，孕酮＜0.1ng/mL。卵巢皮質(zhì)片經(jīng)培養(yǎng)12d后，其E2濃度在新鮮及冷凍復(fù)蘇組織分別達(dá)1054、961pg/ mL。孕酮水平分別為2.31、1.9ng/mL。見(jiàn)圖4。

3 討論

放療和化療技術(shù)的進(jìn)展，極大地提高了年輕腫瘤患者的生存率，然而這些治療對(duì)生育力的影響是致命的[5]。由于社會(huì)及經(jīng)濟(jì)因素的影響，目前選擇晚育的女性不斷增加,因此在診斷為腫瘤時(shí)，要求保存生育力的育齡婦女?dāng)?shù)量不斷增加。卵巢組織的冷凍保存對(duì)于生育力保存是一個(gè)很有前景的方法[6]，它不需要卵巢刺激和供精；卵巢組織冷凍對(duì)于青春期前的女孩是僅有的一種生育力保存方法；同樣也適用于不能接受卵巢刺激而推遲腫瘤治療的單身女性。在這一過(guò)程中，卵巢組織通過(guò)外科手術(shù)切除，去除髓質(zhì)及黃體，僅留薄薄一層皮質(zhì)（約1mm）冷凍保存。經(jīng)過(guò)冷凍，大多數(shù)存活下來(lái)的卵泡是小的原始卵泡，這些原始卵泡代謝不旺盛，缺少透明帶、紡錘體和皮質(zhì)顆粒細(xì)胞，比成熟的卵泡較易耐受冷凍損傷，是卵巢組織冷凍保存的主要對(duì)象。事實(shí)上，卵巢組織冷凍保存已開(kāi)始被作為一種治療手段。但它仍然存在很多的問(wèn)題：一個(gè)主要問(wèn)題是如何簡(jiǎn)單地評(píng)價(jià)冷凍卵巢組織的活力和質(zhì)量。本研究應(yīng)用3種染色方法檢測(cè)凍融前后兔卵巢組織分離卵泡的存活率、激素水平測(cè)定評(píng)價(jià)卵泡的功能。

圖4 冷凍前后分離卵泡經(jīng)體外培養(yǎng)E2及孕酮值的變化

目前卵巢組織尚無(wú)公認(rèn)的冷凍方案，將凍融后的卵巢組織分離出單個(gè)卵泡并檢測(cè)其活性，能夠間接檢驗(yàn)冷凍方案是否達(dá)到滿意的冷凍效果。本研究主要比較3種染色方法（臺(tái)盼藍(lán)、Calcein AM/EH-1、中性紅）對(duì)分離卵泡活力的檢測(cè)能力。臺(tái)盼藍(lán)作為一種排除實(shí)驗(yàn)，不穿透細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，而能通過(guò)死亡卵泡的卵泡膜使卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞染色。鈣黃綠素(Calcein AM)/溴乙非啶同型二聚體(Ethidium homodimer-1，EH-1)雙熒光染色是目前公認(rèn)的檢測(cè)卵泡的存活狀況的指標(biāo),Ethidium homodimer 1能插入DNA中，將膜溶解卵泡的細(xì)胞核染成紅色，Calcein AM是非熒光物質(zhì)，但通過(guò)細(xì)胞膜后，被溶酶體內(nèi)的細(xì)胞酯酶轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光物質(zhì)Calcein，產(chǎn)生綠色熒光。因此通過(guò)對(duì)于卵泡的Calcein AM/EH-1的雙熒光染色，可以判斷卵泡是否存活。中性紅能夠穿透細(xì)胞膜，將膜完整的細(xì)胞染成紅色。這3種方法給出了冷凍前后活力的比較，組織學(xué)評(píng)價(jià)確證了這一結(jié)果。本研究結(jié)果表明，臺(tái)盼藍(lán)與中性紅提供了與CalceinAM/ EH-1相同的信息，而價(jià)格卻是它的1/100。卵巢皮質(zhì)片中卵泡的染色結(jié)果顯示，臺(tái)盼藍(lán)及Calcein AM/EH不能檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況，中性紅作為活細(xì)胞染料可以很好地檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況，有利于對(duì)移植前卵巢組織存活卵泡的數(shù)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究結(jié)果顯示，新鮮卵巢組織的卵泡存活率為84.2%，考慮仍有部分卵泡在前期運(yùn)輸，修整卵巢組織塊時(shí)的機(jī)械切割和擠壓及分離卵泡過(guò)程中使得卵巢組織中的部分卵泡損傷。

冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)卵巢皮質(zhì)片的激素活性測(cè)定是評(píng)價(jià)冷凍方案有效性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。眾所周知，卵巢組織生成類固醇的活性是卵巢活性的一個(gè)附加指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮培養(yǎng)組和冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)組均有E2的分泌，E2的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，提示凍融后組織具有體外發(fā)育潛力，并保持了一定的內(nèi)分泌功能，本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的相似[7]。但需要指出的一點(diǎn)是：我們培養(yǎng)的是卵巢皮質(zhì)片，而不是分離的卵泡，所以類固醇產(chǎn)生不僅僅反映卵泡的發(fā)育情況，有研究表明[8]，取自絕經(jīng)期卵巢皮質(zhì)片中增生的基質(zhì)細(xì)胞也能在在體或離體的情況下產(chǎn)生E2。Isachenko等[9]應(yīng)用玻璃化冷凍和體外培養(yǎng)人的卵巢皮質(zhì)片發(fā)現(xiàn)，盡管在新鮮和培養(yǎng)的皮質(zhì)片中沒(méi)有檢測(cè)到卵泡,孕酮的水平仍然與對(duì)照組一樣高。因此冷凍卵巢組織的內(nèi)分泌功能與生殖功能之間的關(guān)系值得進(jìn)一步的研究。

冷凍卵巢組織的主要目的是自體移植后恢復(fù)患者的生育能力及內(nèi)分泌功能。那么，移植前正確評(píng)價(jià)冷凍組織卵泡的存活及內(nèi)分泌功能是至關(guān)重要的。本研究表明，應(yīng)用便宜的染料臺(tái)盼藍(lán)和中性紅染色可以評(píng)價(jià)分離卵泡的活力，同時(shí)中性紅也可直接用于卵巢皮質(zhì)片中存活卵泡的染色，更適用于移植前卵泡活力的檢測(cè)。激素釋放試驗(yàn)可以間接地檢測(cè)卵泡的功能，提供冷凍效果的信息。

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Objective To establish a simple evaluated methods to assess the vitality and quality of ovarian tissue after freezing-thawing procedures. Methods Ovarian tissues from 10 female rabbits were randomly divided into two groups: fresh group and frozen group. The follicles viability were assessed by trypan blue staining,calcein AM/ethidium homodimer-1 staining and neutral red staining. The function of ovarian tissues were detected by hormone-releasing assays. Results Trypan blue, Calcein AM/EH and neutral red staining have the similar results about ovarian follicle viability assessment. The viability of follicles decreased after freezing and thawing (P＜0.05); E2and Progesterone levels increased after cultured 12 days. The supernatants showed 17-βestradiol concentrations of 1054 and 961pg/mL, and progesterone concentrations of 2.31 and 1.9ng/ mL respectively in fresh and frozen groups. Conclusion Neutral red staining can effectively evaluate the follicle viability; Hormone-releasing test can provide the evidence that the freezing-thawing ovarian tissue has higher developmental potential.

Cryopreservation; Human ovarian tissue; Trypan blue; Neutral red

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.27.001

沈陽(yáng)市科委項(xiàng)目(F14-158-9-13)

遼寧 110014 沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖中心 （劉麗英 曲文玉 孔剛張曉麗 劉曉麗）