乳腺結構紊亂中PAK4的表達及其與影像診斷的相關性

畢研青 郝敏 周海霞 劉效方 王東關

東營市人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，山東東營257091

乳腺結構紊亂中PAK4的表達及其與影像診斷的相關性

畢研青 郝敏#周海霞 劉效方 王東關

東營市人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，山東東營257091

目的觀察乳腺結構紊亂組織中P21活化蛋白激酶4（P21 activated protein kinases 4，PAK4）的表達及其與影像診斷的相關性，探討對乳腺結構紊亂患者手術治療的指導價值。方法回顧性分析了2012年1月至2013年10月150例接受手術治療的女性乳腺疾病患者資料。采用HE染色和PAK4免疫組化染色重新檢測患者的組織標本。結果乳腺非增生性病變組（n=50）、乳腺增生癥組（n=50）、乳腺癌組（n=50）中的PAK4表達陽性率依次升高，且三組兩兩比較的PAK4表達差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。在乳腺癌組中，PAK4表達與鉬靶X線和超聲的早期診斷結果呈正相關性（均P＜0.05）。結論PAK4表達不但在乳腺非增生性病變、乳腺增生癥病變和乳腺癌中依次升高，且與乳腺癌術前影像學診斷結果呈正相關，或可用于指導乳腺結構紊亂疾病的手術治療。

乳腺結構紊亂；乳腺癌；手術治療；影像學；分子生物學；PAK4

Oncol Prog,2015,13(3)

乳腺良性疾?。╞enign breast disease，BBD）已被證實有演變?yōu)閻盒阅[瘤的風險，乳腺結構紊亂是乳腺疾病常見的一種影像學改變，也是乳腺癌演變過程的一個階段。隨著影像學的發(fā)展，更多的檢測手段被用于乳腺疾病的檢查，因此，更多的良性病變被檢測出，這提高了評估某些結構特殊型乳腺癌發(fā)病風險的準確性，對臨床手術治療具有重要的指導意義。乳房穿刺活檢發(fā)現(xiàn)乳腺癌及乳腺增生伴不典型增生毫無疑問是手術指征；但對乳腺增生不伴非典型增生的病變，若影像學提示為結構紊亂的BBD，則并非明確的手術指征?，F(xiàn)代分子生物學證實，在真核細胞的信號轉導過程中，通路蛋白磷酸化/去磷酸化修飾間的平衡在細胞正常信號轉導及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用，PAK4在此途徑中扮演著關鍵的角色。用免疫組化方法檢測PAK4表達水平的變化，對判斷從乳腺增生到惡變這一過程中的危險因素，對乳腺癌的早期診斷及手術指征的評估等均具有重要的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2013年10月在東營市人民醫(yī)院乳腺科住院手術的150例女性乳腺疾病患者標本。其中，非增生性病變患者50例，包括囊腫20例、纖維腺瘤30例；乳腺增生患者50例，包括普通型導管增生（也稱為普通型中度或重度增生）30例，導管內(nèi)乳頭狀瘤病20例；乳腺癌患者50例（均為浸潤性導管癌）。根據(jù)病變類型將患者分為三組，其中非增生病變?yōu)锳組，患者年齡為18～55歲；乳腺增生病變?yōu)锽組，患者年齡為18～56歲；乳腺癌為C組，患者年齡為29～75歲。術前B超、鉬靶X線檢查提示乳腺結構明顯紊亂；術后由本院病理科制取乳腺標本蠟塊，其中部分患者接受乳腺穿刺活檢術取樣。

1.2 研究方法

每個標本蠟塊被切片2份，每份2張，分別進行HE常規(guī)染色和PAK4免疫組化染色。免疫組化染色步驟：標本脫蠟入水（PBS洗2～3次，每次5min），3%H2O2室溫孵育30m in（封閉內(nèi)源性過氧化物酶），蒸餾水洗3次，每次5 m in，浸入PBS中5 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加血清封閉液，置于室溫下20 m in，傾去血清，直接滴加一抗，37℃孵育l～2 h；PBS洗3次，每次5m in，滴加生物素標記的羊抗兔IgG抗體（二抗），37℃孵育10～30 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 m in；PBS洗3次，每次5 m in，DAB-H2O2顯色5～10m in，隨時鏡檢（DAB用時新配）。自來水沖洗10m in，蘇木精復染2m in，鹽酸酒精分化，氨水處理；自來水沖洗10～15 m in，脫水、透明、封片。光鏡下（100倍）觀察乳腺標本的結構及免疫組化染色情況。

免疫組化染色HE染色由本院病理科配制，免疫組化染色PAK4抗體（ab62509）購自Abcam生物技術有限公司。

1.3 染色及影像學判定標準

PAK4主要在乳腺腺體細胞的胞質和（或）胞核中表達，陽性細胞被染成棕黃色或深棕色，采用一抗來源的同品系動物兔的正常IgG作為陰性對照，以此判斷PAK4免疫染色的特異度。結果判斷參照Campo等[1-2]的標準，結合染色強度和細胞染色百分比進行評分。

1.3.1 免疫組化結果判斷標準 著色弱為1分，著色中度為2分，著色強為3分，基本不著色為0分；著色細胞占總細胞數(shù)的5%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分，＜5%為0分。

1.3.2 免疫組化結果評分標準 最后以陽性細胞的百分比和染色強度記分之和所得的總分進行結果判定。0分為陰性，記為（－）；1分、2分為弱陽性，記為（＋）；3分、4分為中等陽性，記為（＋＋）；≥5分為強陽性，記為（＋＋＋）。

1.3.3 抗體陽性判斷標準 PAK4免疫組化染色累計評分≥3分（中等陽性，強陽性）者為陽性，＜3分（陰性，弱陽性）者為陰性。免疫組化檢測結果由兩位病理學家在相同的判斷標準下雙盲判定，相同判定結果直接納入統(tǒng)計，有差異的結果經(jīng)第三位病理學家盲法判定后取三位病理學家判定結果的平均值納入統(tǒng)計。

1.3.4 鉬靶X線陽性判斷標準 鉬靶X線結果提示為簇狀、泥沙樣鈣化或者毛刺樣征，邊緣模糊的結節(jié)影，美國放射學會乳腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）分級為Ⅳ～Ⅴ級者被判定為陽性結果。

1.3.5 彩超陽性判斷標準 彩超提示腫塊形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，呈毛刺狀或蟹足狀，內(nèi)部回聲不均勻；腫塊內(nèi)見微小鈣化灶，腫塊后方回聲衰減、腫塊縱橫比＞1；腫塊內(nèi)血流信號Ⅱ～Ⅲ級，阻力指數(shù)＞0.7，提示占位性病變者被判定為陽性結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩個或多個構成比的比較采用χ2檢驗，等級資料相關性采用Spearman相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PAK4在各組研究中的表達情況

PAK4在正常乳腺組織中是不著色的。本研究中，乳腺非增生性病變組（A組）、乳腺增生病變組（B組）、乳腺癌組（C組）中的PAK4表達陽性率依次升高，且差異有統(tǒng)計學意義；A、B、C三組中的PAK4表達情況兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（表1，圖1～4）。

表1 三組研究對象PAK4表達情況的比較（例）

2.2 乳腺癌患者影像學特征及PAK4表達情況

50例乳腺癌組（C組）中，術前鉬靶X線判定為陽性表達者有39例（78%），PAK4染色陽性者也為39例；PAK4表達與鉬靶X線陽性結果呈正相關性（表2）。

50例乳腺癌組（C組）中，術前彩超判定為陽性者有41例（82%），PAK4染色陽性者為39例；PAK4表達與彩超陽性結果呈正相關性（表2）。

3 討論

據(jù)流行病學研究結果顯示，乳腺不典型增生發(fā)展成為乳腺癌的危險性顯著增加[3]。乳腺增生包括、乳腺小葉增生癥、纖維化增生癥、乳腺癌（部分乳腺癌為乳腺增生病惡變所致）。乳腺增生與乳腺癌的關系是患者最關心的問題，也是眾多學者爭論和研究的焦點。眾多研究[4-6]均已表明：相對于非增生性乳腺良性疾病，乳腺增生不伴非典型增生者的乳腺癌發(fā)病風險可小幅增加，而乳腺增生伴非典型增生患者的乳腺癌發(fā)病率明顯升高。

表2 影像學特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達情況

影像學檢查為早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷乳腺癌的主要方法。乳腺鉬靶X線攝影具有較好的病變凸顯性能、價格低、簡單實用性的特點，因而被作為無癥狀女性乳腺癌篩查的首選。超聲檢查無射線損傷，尤其適合妊娠、哺乳期婦女檢查及乳腺疾病的普查和隨訪。兩者結合被稱為檢查乳腺癌的“黃金組合”[7-8]。PAK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最早發(fā)現(xiàn)時被作為Rho GTP酶Cdc42和Racl的特異性結合物[9]，PAK4參與Cdc42Hs與肌動蛋白細胞骨架的相互作用[10]，PAK4能在多種腫瘤細胞中高表達[11-13]。一些研究表明，PAK4在上皮細胞轉化過程中也發(fā)揮關鍵作用[14-16]。乳腺癌是被廣泛研究的上皮細胞癌癥轉化的典型疾病。大量研究顯示，PAK4不但在乳腺癌組織中的表達遠高于在其他腫瘤中的表達[17-19]，而且PAK4表達與乳腺癌細胞的增殖和侵襲轉移呈正相關[20-21]。

PAK4在正常乳腺組織中是不表達的。在本研究中（圖1～4），乳腺非增生性病變、乳腺增生病變和乳腺癌中的PAK4表達陽性率依次升高。對乳腺非增生性病變組、乳腺增生病變組和乳腺癌組病變中PAK4的表達進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

對50例乳腺癌患者術前彩超及鉬靶X線診斷與PAK4表達情況進行了相關性研究，發(fā)現(xiàn)PAK4染色結果與兩種影像學檢查的乳腺癌早期診斷呈正相關。鑒于乳腺增生不伴非典型增生且影像學提示存在明顯結構紊亂的BBD尚缺乏明確的手術指征，筆者認為：結合患者臨床病史、查體及影像學檢查，針對部分乳腺增生合并結構紊亂的患者，乳腺組織穿刺聯(lián)合PAK4檢測可以判斷乳腺從增生疾病到惡變這一過程中的危險因素，為手術治療提供重要的參考依據(jù)。后續(xù)研究將著重于乳腺良性疾病向乳腺癌發(fā)展過程中PAK4的具體變化，以期進一步明確PAK4在乳腺增生合并影像學結構紊亂疾病手術治療中的價值。

［1］CamPo E,Merino MJ,Liotta L,et al.Distribution of the72-kd type IV collagenase in nonneoplastie and neoplastic thyroid tissue[J].Hum Pathol,1992,23(12): 1395-1401.

［2］Cotteret S,Jaffer ZM,BeeserA,et al.P21-activated kinase 4 localizes to itochondria and inhibits apoptosis by phosphorylating BAD[J].Mol Cell Biol,2003,23(16), 5526-5539.

［3］Hartmann LC,Degnim AC,Santen RJ,et al.Atypical hyperplasia of the breast-risk assessment and management options[J].N Engl JMed,2015,372(1):78-89.

［4］Dupont WD,Page DL.Risk factors for breast cancer in women w ith proliferative breast disease[J].N Engl J Med,1985,312(3):146-151.

［5］Page DL,DupontWD,Rogers LW,et al.Atypical hyperplastic lesions of the female breast:a long-term followup study[J].Cancer,1985,55(11):2698-2708.

［6］Kabat GC,Jones JG,Olson N,et al.A multi-center prospective cohort study of benign breast diseaseand risk of subsequent breast cancer[J].Cancer Causes Control, 2010,21(6):821-828.

［7］陳武飛,劉海泉,滑炎卿.乳腺癌影像學診斷研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(11): 4973-4975.

［8］周立民,王長青.乳腺鈣化在乳腺鉬靶診斷中的價值[J].中國當代醫(yī)學,2013,20(27):28-30.

［9］Manser E,Leung T,Salihuddin H,et al.A brain serine/ threonine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1 [J].Nature,1994,367(6458):40-46.

［10］Abo A,Qu J,Cammarano MS,et al.PAK4,a novel effector for Cdc42Hs,is implicated in the reorganization of the actin cytoskeleton and in the formation of filopodia[J].EMBO,1998,17(22):6527-6540.

［11］Lu W,Xia YH,Qu JJ,et al.P21-activated kinase 4 regulation of endometrial cancer cell m igration and invasion involves the ERK1/2 pathway mediated MMP-2 secretion[J].Neoplasma,2013,60(5):493-503.

［12］TyagiN,Bhardwaj A,Singh AP,etal.P-21 activated kinase 4 promotes proliferation and survivalof pancreaticcancer cells through AKT-and ERK-dependent activation of NF-κB pathway[J].Oncotarget,2014,5(18): 8778-8789.

［13］Wang C,Li Y,Zhang H,et al.Oncogenic PAK4 regulates Smad2/3 axis involving gastric tumorigenesis[J]. Oncogene,2014,33(26):3473-3484.

［14］Nekrasova T,M inden A.PAK4 is required forregulation of the cell-cycle regulatory protein p21,andfor control of cell-cycle progression[J].J Cell Biochem, 2011,112(7):1795-1806.

［15］Wong LE,Chen N,Karantza V,et al.The Pak4 protein kinase is required for oncogenic transformation of MDA-MB-231 breast cancer cells[J].Oncogenesis, 2013,2:e50.

［16］Liu Y,Chen N,Cui X,et al.The protein kinase Pak4 disrupts mammary acinar architecture and promotes mammary tumorigenesis[J].Oncogene,2010,29(44): 5883-5894.

［17］M inden A.The Pak4 protein kinase in breast cancer[J]. ISRN Oncology,2012,2012:694201.

［18］Li Y,Wang D,Zhang H,et al.P21-activated kinase 4 regulates the Cyclin-dependent kinase inhibitor P57Kip2 in human breast cancer[J].Anat Rec(Hoboken),2013,296(10):1561-1567.

［19］Paliouras GN,Naujokas MA,Park M.Pak4,a novel gab1 binding partner,modulates cell m igration and invasion by the Met receptor?[J].Mol Cell Biol,2009,29 (11):3018-3032.

［20］Wells CM,Jones GE.The emerging importance of groupⅡPAKs[J].Biochem J,2010,425(3):465-473.

［21］Siu MK,Chan HY,Kong DS,et al.P21-Activatedkinase 4 regulates ovarian cancer cell proliferation,m igration,and invasion and contributes to poorprognosis in patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(43): 18622-18627.

［22］Li Z,Lock JG,Olofsson H,et al.Integrin-mediatedcell attachment induces a PAK4-dependent feedbackloop regulating cell adhesion through modified integrinalpha v beta 5 clustering and turnover[J].Mol Biol Cell, 2010,21(19):3317-3329.

Theexpression of PAK4 in structuraldisorderofmammary gland and its correlation w ith diagnostic imaging

BIYan-qing HAOM in#ZHOU Hai-xia LIU Xiao-fang WANG Dong-guan

Departmentof Thyroid and BreastSurgery,the People's Hospitalof Dongying,Dongying 257091,Shandong China

ObjectiveTo observe the PAK4(P21 activated protein kinases 4)expression in structural disorder of mammary gland,and to investigate the correlation between PAK4 and diagnostic imaging to guide surgery.Method150 female patients w ith breast disease who had surgeries during 2012 to 2013 were retrospectively analyzed.HE staining and PAK4 immunohistochemical staining were used to investigate the structure ofmammary gland in the paraffin-embedded samples.ResultThe incidence of positive PAK4 expression increased in non-hyperplasia group(n= 50),hyperplasia group(n=50)and the breast cancer group(n=50),and the differences between groups were significant(all P<0.05).PAK4 expression in breast cancer group was positively correlated w ith early diagnostic results of mammography and ultrasonography.ConclusionThe PAK4 expression increased in non-hyperplasia/hyperplasia of mammary gland,and breast cancer,besides,the PAK 4 expression was positively correlated w ith preoperative imaging diagnosis results,and m ight be an indicator for breast surgeries for structural disorder ofmammary gland disease.

structural disorder ofmammary gland;breast cancer;surgical treatment;molecular biology;PAK4

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.13

#通信作者（corresponding author），e-mail：haom in166@163.com

2014-11-06）