磁珠聯(lián)合MALDI－TOF－MS篩選尿液中早期腎透明細(xì)胞癌多肽標(biāo)志物

付德來，種 鐵，李和程，張 鵬，劉洪濤，王子明

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1．泌尿外科，2．麻醉科，陜西西安 710004）

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升。早期腎癌缺乏特異性表現(xiàn)，多由健康查體偶然發(fā)現(xiàn)，約1／3的腎癌患者首次就診時(shí)已處于晚期。目前晚期腎癌缺乏有效的治療手段，預(yù)后較差。尋找腎癌標(biāo)志物對于提高腎癌的早期診斷水平、研究腎癌發(fā)病機(jī)制、改善腎癌預(yù)后具有重要意義。本課題以腎癌患者尿液作為研究對象，采用磁珠聯(lián)合 MALDI－TOFMS技術(shù)，探索尿液中可能存在的腎癌多肽標(biāo)志物。

1 材料與方法

1．1 研究對象實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，按照知情同意的原則篩選2009年3～12月期間西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科住院的患者，包括腎患者、非腎癌腎臟病變患者（腎積水、腎錯(cuò)構(gòu)瘤、腎盂癌、腎囊腫、腎結(jié)核、腎結(jié)石），以及另外3名健康志愿者。入組腎癌患者均為行根治性手術(shù)治療的早期腎癌（AJCC腎癌TNM分期T1～2N0M0期）患者，且病理類型為腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。

1．2 主要儀器及試劑MALDI－TOF－MS質(zhì)譜分析儀購自德國Bruker公司，銅螯合納米磁珠試劑盒購自北京國家生物醫(yī)學(xué)分析中心。

1．3 方法

1．3．1 尿液的收集與處理 收集患者及志愿者晨起空腹第二次排尿中段尿液標(biāo)本約10mL，分為術(shù)前組（腎癌患者入院第7天尿液）、術(shù)后組（腎癌患者術(shù)后第7天尿液）和對照組（非腎癌腎臟病變患者入院第2天和同期健康志愿者尿液）。尿液標(biāo)本經(jīng)低溫離心機(jī)4 000r／min離心10min，獲得的上清液2mL／管分裝，－80℃保存。尿液標(biāo)本從收集到離心完畢分裝凍存需在1h內(nèi)完成。

1．3．2 MALDI－TOF－MS分析尿液多肽組 參考銅螯合納米磁珠試劑盒使用說明書及吳杰等［1］的報(bào)道提取尿液中多肽。獲得的多肽提取液1μL和等體積飽和α－羥基肉桂酸（CCA）基質(zhì)溶液混勻，點(diǎn)在 MALDI不銹鋼靶面上，室溫下自然干燥，放入U(xiǎn)ltraflexⅢ MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。檢測條件設(shè)置如下：N2激光源，波長337nm，正離子線性模式，掃描相對分子質(zhì)量范圍800～10 000Du，激光能量36%，每個(gè)樣疊加2 000張譜圖。

1．3．3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理與分析 參考鐘立業(yè)等［2］的報(bào)道，質(zhì)譜采集獲得的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用 MALDI－TOF－MS專門的分析軟件ClinProTools2．2進(jìn)行分析。首先調(diào)入各組樣品的數(shù)據(jù)，對采集圖像進(jìn)行歸一化處理，經(jīng)過基線的平滑、去背景、標(biāo)峰后，產(chǎn)生一張所有樣品的平均譜圖，篩選此譜圖上信噪比≥7的譜峰作為高可信譜峰。調(diào)入各個(gè)樣品數(shù)據(jù)，查高可信譜峰在各組不同樣品內(nèi)表達(dá)情況，采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析各高可信譜峰在各組表達(dá)情況，組間差異P＜0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．3．4 差異多肽的數(shù)據(jù)庫搜索初步鑒定 有意義多肽采用Tagldent檢索程序搜索 UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。在Tagldent檢索頁面（http：／／us．expasy．org／tools／tagldent．html），在“Mw”一欄輸入目的多肽的分子質(zhì)量，在“Organism name”一欄輸入篩選條件“homo sapiens”，點(diǎn)擊“Start Tagldent”進(jìn)行搜索。

2 結(jié) 果

2．1 基本信息共收集得到167份尿液標(biāo)本，經(jīng)篩選獲得符合入組條件的腎癌患者術(shù)前組、術(shù)后組尿液標(biāo)本各32份，對照組尿液標(biāo)本34份，入組患者基本信息無明顯差異（表1）。

表1 研究對象基本資料

2．2 各組尿多肽表達(dá)譜術(shù)前組、術(shù)后組、對照組分別共檢測到115、105、128個(gè)多肽信號峰，分析發(fā)現(xiàn)84．48%的信號峰集中分布于 ［1 000～6 000Du］之間，僅有13．51%的信號峰分布于 ［6 001～10 000Du］之間（圖1）。ClinProTools 2．2對所有樣品譜圖歸一化處理后獲得平均譜圖，在相對分子質(zhì)量800～10 000Du范圍內(nèi)，共鑒定出信噪比≥7的高可信多肽峰12個(gè)，其m／z分別為854、1 025、1 116、1 315、2 790、3 176、3 297、4 750、5 557、8 817、9 730、9 923。各組之間信號峰集合分布既相互獨(dú)立又有交集（圖2）。

2．3 差異多肽峰篩選以峰面積代表多肽的表達(dá)量，比較信噪比≥7的高可信多肽在各組表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)m／z＝1 025、1 116的多肽在術(shù)前組高表達(dá)，同時(shí)在術(shù)后組、對照組低表達(dá)。m／z＝9 730的多肽在術(shù)后組、對照組高表達(dá)，在術(shù)前組低表達(dá)。m／z＝2 790、4 750的多肽在三組表達(dá)無差異（表2、圖3）。其余7個(gè)高可信多肽峰表達(dá)不穩(wěn)定，僅出現(xiàn)于個(gè)別樣品中。

圖1 各組尿液多肽表達(dá)譜

表2 不同質(zhì)荷比多肽在各組中相對表達(dá)量

2．4 差異多肽峰的檢索鑒定采用Tagldent檢索程序檢索UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫對相關(guān)多肽進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m／z＝1 025、1 116、9 730的信號峰與多個(gè)多肽或蛋白相匹配（表3）。

表3 差異多肽的初步鑒定

圖2 各組多肽信號峰集合分布

圖3 術(shù)前組高表達(dá)（m／z＝1 025、1 116）、低表達(dá)（m／z＝9 730）的多肽

3 討 論

腫瘤標(biāo)志物（tumor marker）是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。腎癌標(biāo)志物一方面可以經(jīng)血液循環(huán)、由腎小球過濾進(jìn)入尿液，另一方面可經(jīng)腎小管分泌直接進(jìn)入尿液［3］。尿液采集方便，其蛋白質(zhì)組的組成較血漿簡單，是篩選腎癌標(biāo)志物的理想標(biāo)本。磁珠聯(lián)合MALDI－TOF－MS技術(shù)檢測尿液多肽組具有簡便快速、標(biāo)本用量少的優(yōu)點(diǎn)［1］，已用于腎小球疾病尿液多肽組研究［4］。

尿液多肽組表達(dá)譜受到尿液留存時(shí)間、飲食、藥物、疾病、遺傳背景等各種因素的影響。本課題通過選用合理的尿液標(biāo)本和設(shè)計(jì)雙重對照篩選尿液中腎癌特異性多肽標(biāo)志物。首先，為減少尿液留存時(shí)間、飲食、藥物對尿液多肽表達(dá)譜多肽表達(dá)譜的影響，本課題采用晨起空腹第二次排尿中段尿液標(biāo)本。同時(shí)，本課題對照組包含了健康志愿者和非腎癌腎臟病變（腎積水、腎囊腫、腎血管平滑肌脂肪瘤、腎盂癌、腎結(jié)核、腎結(jié)石），這樣不僅將腎癌患者和健康人尿液多肽譜區(qū)別開來，同時(shí)還將腎癌患者和各種非腎癌腎臟病變者尿液多肽譜區(qū)別。另外，本課題還采用腎癌患者術(shù)前術(shù)后自身對照，這樣就減少了基因組差異對尿多肽組的影響。我們期望根治性腎切除術(shù)后尿液中腎癌標(biāo)志分子會(huì)減少或消失，所以在患者選擇上僅采用了行根治性腎切除術(shù)的早期腎癌（Ⅰ、Ⅱ期）患者。至于術(shù)后標(biāo)本收集時(shí)間點(diǎn)的選擇，目前有限的文獻(xiàn)并沒有明確答案，原則上術(shù)后時(shí)間越長尿液中腎癌特異性標(biāo)志物代謝完全的幾率越大?？紤]到實(shí)驗(yàn)的易實(shí)施性，我們收集了患者術(shù)后第7天的尿液標(biāo)本。

3．1 尿液中腎癌多肽標(biāo)志物目前已有多篇文獻(xiàn)通過組學(xué)技術(shù)尋找尿液中腎癌特異性多肽（表4）。分析既往數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，各研究中篩選出的腎癌相關(guān)分子缺乏一致性，這可能與尿液多肽組表達(dá)譜受眾多因素影響有關(guān)。結(jié)合既往研究進(jìn)一步分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們驚喜發(fā)現(xiàn)，本研究中m／z為1 116的多肽在腎癌組及對照組中的表達(dá)規(guī)律與CHINELLO等［5］的研究一致，這充分說明尿液中m／z為1 116的多肽與腎癌關(guān)系密切，可能是尿液中潛在的腎癌特異性標(biāo)志分子。

表4 腎癌尿液多肽標(biāo)志物研究一覽表

3．2 m／z＝1025多肽初步鑒定分析通過Tagldent檢索程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)m／z＝1025的多肽與urotensin－ⅡB、little LEN相吻合。Urotensin－ⅡB屬于urotensinⅡ家族，是一個(gè)含有8個(gè)氨基酸的分泌多肽。UrotensinⅡ最初從蝦虎魚（Goby fish）尾部下垂體中獲得，具有強(qiáng)烈的絲裂原作用。YOSHIMOTO等［10］發(fā)現(xiàn)腎癌VMRC－RCW細(xì)胞系培養(yǎng)液中可檢測到urotensinⅡ表達(dá)，提示腎癌細(xì)胞可分泌urotensinⅡ。外源性給予urotensinⅡ24h后，腎癌VMRC－RCW細(xì)胞密度明顯增加。王文營等［11］通過免疫組化和RTPCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，urotensinⅡ在腎透明細(xì)胞癌和正常腎組織中均有表達(dá)，腎透明細(xì)胞癌中urotensinⅡ及其受體mRNA的表達(dá)明顯高于正常腎組織。

Little LEN是Pro－SAAS（proprotein convertase 1inhibitor）剪切產(chǎn)生的7個(gè)片段之一，由10個(gè)氨基酸組成。Pro－SAAS參與神經(jīng)內(nèi)分泌通路，可能是內(nèi)源性、特異性PCSK1抑制劑。Little LEN的詳細(xì)功能尚不得而知。

3．3 m／z＝1 116多肽初步鑒定分析Tagldent程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)m／z＝1 116的多肽與胃泌素釋放肽（gastine－releasing peptide，GRP）吻合。GRP是胃泌素釋放肽前體（proGRP1－125）羧基端的10個(gè)肽。HEUSER 等［12］研究發(fā)現(xiàn)GRP受體（GRPR）在RCC細(xì)胞及腫瘤血管高表達(dá)。PANSKY等［13］研究發(fā)現(xiàn)GRPR在腎癌組織中表達(dá)，在正常腎組織中不表達(dá)。最近ISCHIA等［14］通過ELISA、放免法定量檢測腎癌細(xì)胞系GRP表達(dá)及功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、Caki－1、Caki－2均高表達(dá)GRP，外源性GRP可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人腎癌ACHN、Caki－2細(xì)胞增殖，可增強(qiáng)ACHN細(xì)胞的遷移能力。GPR可誘導(dǎo)ACHN、Caki－2細(xì)胞分裂關(guān)鍵酶ERK1／2快速磷酸化，可上調(diào)ACHN腎癌細(xì)胞 HIF1－α、VEGF的表達(dá)。

本研究及CHINELLOC等［5］的研究均提示m／z為1 116的多肽在腎患者尿液中高表達(dá)，Tagldent程序提示此多肽極有可能為GRP。結(jié)合上述研究，我們有理由相信GRP與腎癌關(guān)系密切，GRP在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用值得深入研究，GRP及其代謝產(chǎn)物在腎癌患者尿液中的檢測價(jià)值亦值得進(jìn)一步探討。

3．4 m／z＝9 730多肽初步鑒定分析Tagldent程序檢索發(fā)現(xiàn)m／z＝9 730的多肽與EA－92、Late cornified envelope protein 3C（LCE3C）、Heparin－binding EGF－like growth factor（HB－EGF）相吻合。

EA－92是chromogranin－A剪切產(chǎn)生的13個(gè)片段之一。chromogranin－A最早在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻顆粒中被發(fā)現(xiàn)，具有穩(wěn)定嗜鉻顆粒的作用，chromogranin－A與兒茶酚胺一起分泌。chromogranin－A在大約90%的腸源性神經(jīng)內(nèi)分泌癌表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤負(fù)荷及復(fù)發(fā)相關(guān)，有效治療后chromogranin－A水平往往下降［15］。chromogranin－A在腎癌中的表達(dá)與腸源性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤存在差異。RASMUSON等［16］早在1999年就對比分析了200例腎癌患者和15例腎囊腫患者chromogranin－A水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28例（14%）腎癌患者血清chromogranin－A水平升高，但與對照組比較缺乏顯著性差異。多因素分析發(fā)現(xiàn)chromogranin－A不是腎癌預(yù)后影響因子。2010年RONKAINEN等［17］通過免疫組化分析chromogranin－A在152例原發(fā)性腎癌中表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)chromogranin－A免疫組化染色全為陰性。

LCE3C又稱富含脯氨酸的表皮分化小復(fù)合蛋白3A（Small proline－rich－like epidermal differentiation complex protein 3A），主要見于某些皮膚疾病［18－19］，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義尚不明確。

HB－EGF是EGF家族成員之一，可參與胚囊著床、骨骼肌發(fā)育、心肌分化、腎小管形成、傷口修復(fù)和腫瘤發(fā)生。TAKEMURA 等［20］發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合 HBEGF可保護(hù)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞耐受H2O2及足葉乙甙（etoposide）的殺傷，膜結(jié)合 HB－EGF可增加腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡。在無血清培養(yǎng)下，膜結(jié)合HB－EGF可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞粘附并形成上皮細(xì)胞克隆。無血清培養(yǎng)3d后膜結(jié)合HB－EGF組細(xì)胞存活率84%，對照組存活率0%。大鼠正常腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)染HB－EGF后可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［21］。SCHAFER 等［22］研究發(fā)現(xiàn) HBEGF可特異性地誘導(dǎo)腎癌Caki2、ACHN、A498細(xì)胞系EGFR的過度轉(zhuǎn)錄激活。

本研究中m／z＝9 730的多肽在腎癌術(shù)前組低表達(dá)，在腎癌術(shù)后組、對照組高表達(dá)，結(jié)合目前EA－92、LCE3C、HB－EGF有關(guān)研究結(jié)果，本研究中 m／z＝9 730的多肽與EA－92有關(guān)研究相吻合。EA－92及其前體chromogranin－A在腎癌中低表達(dá)，EA－92及chromogranin－A與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

本研究通過磁珠聯(lián)合 MALDI－TOF－MS技術(shù)分析腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組及對照組尿液中多肽標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)多肽差異表達(dá)（m／z＝1 025、1 116的多肽在腎癌術(shù)前組高表達(dá)，m／z＝9 730的多肽在腎癌術(shù)前組低表達(dá)）。通過Tagldent檢索程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中對這些多肽進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)了多個(gè)匹配分子。這些多肽或其對應(yīng)的蛋白在腎癌和／或腎癌患者尿液中的表達(dá)需進(jìn)一步明確，其作為尿液中腎癌標(biāo)志分子的意義值得深入研究。

［1］吳杰，王杰，李燕，等．銅螯合納米磁珠結(jié)合 MALDI－TOF／TOF MS分析人尿液中多肽組的方法初探［J］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2009，33（2）：137－140，196．

［2］鐘立業(yè)，劉天浩，耿素霞，等．利用 MALDI－TOF－MS分析RAEB型骨髓增生異常綜合癥患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征［J］．中華腫瘤防治雜志，2009，16（21）：1625－1627．

［3］GONZáLEZ－BUITRAGO JM，F(xiàn)ERREIRA L，LORENZOI．U－rinary proteomics［J］．Clin Chem Acta，2007，375：49－56．

［4］吳杰，李燕，謝院生，等．磁珠分離結(jié)合生物質(zhì)譜分析腎小球疾病患者尿液多肽譜［J］．中華腎臟病雜志，2009，25（8）：596－600．

［5］CHINELLO C，CAZZANIGA M，SIO GD，et al．Urinary signatures of renal cell carcinoma investigated by peptidomic approaches［J］．PloS One，2014，9（9）：e106684．

［6］ROGERS MA，CLARKE P，NOBLEJ，et al．Proteomic profiling of urinary proteins in renal cancer by surface enhanced laser desorption ionization and neural－network analysis：identification of key issues affecting potential clinical utility［J］．Cancer Res，2003，63（20）：6971－6983．

［7］吳登龍，王文靜，關(guān)明，等．表面增強(qiáng)激光解吸／離子化質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在篩選腎癌患者尿液標(biāo)記物中的應(yīng)用［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（13）：1092－1095．

［8］BOSSO N，CHINELLO C，PICOZZI SCM，et al．Human urine biomarkers of renal cell carcinoma evaluated by ClinProt［J］．Prot Clin Appli，2008，2（7－8）：1036－1046．

［9］FRANTZIA M，METZGERA J，BANKSC RE，et al．Discovery and validation of urinary biomarkers for detection of renal cell carcinoma［J］．J Prot，2014，98：44－58．

［10］YOSHIMOTO T，MIKA MATSUSHITA，HIRATA Y．Role of urotensin II in peripheral tissue as an autocrine／paracrine growth factor［J］．Peptides，2004，25（10）：1775－1781．

［11］王文營，王紅霞，張立克，等．尾加壓素Ⅱ及其受體在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義［J］．臨床泌尿外科雜志，2010，25（7）：510－513．

［12］HEUSER M，SCHLOTT T，SCHALLY A，et al．Expression of gastrin releasing peptide receptor in renal cell carcinomas：a potential function for the regulation of neoangiogenesis and microvascular perfusion［J］．J Urol，2005，173（6）：2154－2159．

［13］PANSKY A，WEERTH AD，F(xiàn)ASLER－KAN E，et al．Gastrin releasing peptide－preferring bombesin receptors mediate growth of human renal cell carcinoma［J］．J Amer Soci Nephrol，2000，11（8）：1409－1418．

［14］ISCHIA J，PATEL O，SETHI K，et al．Identification of binding sites for C－terminal pro－gastrin－releasing peptide（GRP）－derived peptides in renal cell carcinoma：apotential target for future therapy［J］．Bri J Urol Int，2015，115（5）：829－838．

［15］MODLIN M，GUSTAFSSON B，MOSSS，et al．Chromogranin a－biological function and clinical utility in neuro endocrine tumor disease［J］．Ann Surg Oncol，2010，17（9）：2427－2443．

［16］RASMUSON T，GRANKVIST K，ROOS G，et al．Neuroendocrine differentiation in renal cell carcinoma［J］．Acta Oncol，1999，38（5）：623－628．

［17］RONKAINEN H，SOINI Y，VAARALA MH，et al．Evaluation of neuroendocrine markers in renal cell carcinoma［J］．Diagn Pathol，2010，5：28．

［18］CID RD，RIVEIRA－MUNOZ E，ZEEUWENPLJM，et al．Deletion of the late cornified envelope LCE3Band LCE3Cgenes as a susceptibility factor for psoriasis［J］．Nat Gene，2009，41（2）：211－215．

［19］COTO E，SANTOS－JUANES J，COTO－SEGURA P，et al．Mutation analysis of the LCE3B／LCE3Cgenes in Psoriasis［J］．BMC Med Gen，2010，11：45－51．

［20］TAKEMURA T，KONDO S，HOMMA T，et al．The membrane－bound form of heparin－binding epidermal growth factorlike growth factor promotes survival of cultured renal epithelial cells［J］．J Bio Chem，1997，272（49）：31036－31042．

［21］FU SL，BOTTOLI I，GOLLER M，et al．Heparin－binding epidermal growth factor－like growth factor，a v－Jun target gene，induces oncogenic transformation［J］．Proceed Nati Aca Sci USA，1999，11（96）：5716－5721．

［22］SCHAFER B，GSCHWIND A，ULLRICH A．Multiple G－protein－coupled receptor signals converge on the epidermal growth factor receptor to promote emigration and invasion［J］．Oncogene，2004，23（4）：991－999．