Zn2+、Ca2+和Mn2+對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的協(xié)同影響

付友思，吳又多，陳麗杰

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

當(dāng)今石油資源日漸枯竭，生物發(fā)酵法生產(chǎn)石油替代物丁醇重新得到關(guān)注[1-2]。與乙醇相比，丁醇具有腐蝕性低、燃燒熱高和可直接使用管道輸送等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，可以直接代替石油應(yīng)用到現(xiàn)有汽車發(fā)動(dòng)機(jī)，被認(rèn)為是一種極具潛力的新一代生物能源[5-6]。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵使用菌株為丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性梭狀細(xì)菌，發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮、丁醇和乙醇（ABE 發(fā) 酵）[7-8]，丙酮丁醇梭菌生長(zhǎng)存在明顯的“兩相”過(guò)程，即產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)酸期菌體消耗底物快速生長(zhǎng)，產(chǎn)生乙酸和丁酸；產(chǎn)溶劑期菌體重新吸收細(xì)胞外有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為丙酮、丁醇和乙醇[9-10]。細(xì)胞內(nèi)未解離的分子態(tài)丁酸（UBA）濃度是影響產(chǎn)酸期轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)溶劑期的關(guān)鍵因素之一[11]，Terracciano 等[12]認(rèn)為發(fā)酵過(guò)程由產(chǎn)酸期進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的條件是細(xì)胞內(nèi)分子態(tài)丁酸濃度為13～18mmol/L。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)向ABE 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丁酸會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程丁酸的生成，并能夠促進(jìn)吸收細(xì)胞外丁酸，增加了細(xì)胞內(nèi)丁酸磷酰化水平，進(jìn)而顯著提高ABE 發(fā)酵過(guò)程中底物糖轉(zhuǎn)化率、有機(jī)溶劑的產(chǎn)量和產(chǎn)率[13-14]。

已有研究工作表明金屬元素對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵具有重要的調(diào)控作用，鋅（Zn）是微生物代謝過(guò)程中重要金屬元素，是許多關(guān)鍵酶的輔基[15]，如堿性磷酸酶和乙醇脫氫酶[16-17]。作者課題組前期工作發(fā)現(xiàn)在向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.001g/L ZnSO4·H2O 條件下，能夠顯著提高丁醇發(fā)酵底物糖利用率和菌體代謝速率，可以促進(jìn)有機(jī)酸重吸收作用，縮短發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)而提高丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量、產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率[18]。此外，已有研究證明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4.0g/L 碳酸鈣（CaCO3）對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵有重要的調(diào)控作 用[19]。事實(shí)上，CaCO3的調(diào)控作用在丁醇發(fā)酵中主要表現(xiàn)在兩方面，一方面Ca2+是蛋白酶激活劑，能改變細(xì)胞膜通透性，增強(qiáng)菌體丁醇耐受性；另一方面CO32-表現(xiàn)出有效的pH 緩沖作用[20]。除金屬元素Zn 和Ca 之外，錳（Mn）被認(rèn)為是微生物所必須金屬元素之一[21]，同時(shí)還是一些酶的輔助因子，如ABE 發(fā)酵代謝過(guò)程中的乙酸激酶（AK）的活性需要錳離子[22]，這些金屬元素各自對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵有著重要的調(diào)控作用，然而目前尚未有針對(duì)Zn2+、Ca2+和Mn2+協(xié)同調(diào)控丙酮丁醇發(fā)酵的研究報(bào)道。本文研究了Zn2+、Ca2+和Mn2+3 種金屬離子對(duì)ABE發(fā)酵的協(xié)同調(diào)控作用，并進(jìn)一步研究在3 種金屬離子共存條件下對(duì)丁酸代謝的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌Clostridium acetobutylicumL7。

1.2 培養(yǎng)基組成

活化培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨30，葡萄糖20，酵母粉10，自然pH 值。

搖瓶/種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖70，乙酸銨3.2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，自然pH 值。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖70，乙酸銨3.2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，初始pH 值5.5。

以上培養(yǎng)基通入氮?dú)獬酰?21℃蒸汽滅菌15min。

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化：將冷凍保藏的5mL 菌種溫育后接種于100mL 活化培養(yǎng)基中，37.5℃厭氧培養(yǎng)20h，用于種子及搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)：將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于100mL 種子培養(yǎng)基中，于溫度37.5℃厭氧培養(yǎng)24h，用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于 100mL 搖瓶培養(yǎng)基中，于溫度37.5℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)72h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將活化好的種子培養(yǎng)基以體積比10%的接種量接種于1 L 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度37.5℃，150 r/min 培養(yǎng)72h。

1.4 分析方法

葡萄糖濃度測(cè)定使用葡萄糖分析儀（SBA-40C生物傳感分析儀）：將發(fā)酵上清液中葡萄糖濃度稀釋到1g/L 以下，取25μL 進(jìn)樣，根據(jù)傳感儀讀數(shù)及稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品中葡萄糖濃度。

生物量測(cè)定方法：在620 nm 處測(cè)定菌體的吸光度（OD620）作為菌體濃度。

使用氣相色譜HP-INNOWAX（19091N-233）測(cè)定溶劑各組分，F(xiàn)ID 檢測(cè)器。色譜條件：毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.50 μm），柱溫100℃；進(jìn)樣溫度250℃；FID 檢測(cè)器溫度300℃，H2流速40mL/min，空氣流速400mL/min；載氣N2流速30mL/min；進(jìn)樣量0.1μL，分流比50∶1。采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

乙酸和丁酸濃度使用Waters 1525 高效液相色譜測(cè)定，色譜分離條件：Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱（30cm×7.8mm；Bio-Rad，Hercules），流動(dòng)相為5mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 添加Zn2+和Ca2+對(duì)ABE 發(fā)酵的影響

根據(jù)前期研究結(jié)果，Zn2+或Ca2+對(duì)ABE 發(fā)酵存在顯著調(diào)控作用[18-19]，二者都能夠有效提高ABE發(fā)酵有機(jī)溶劑產(chǎn)量，然而二者共同存在條件下的ABE 發(fā)酵尚無(wú)研究揭示。因此，本研究在0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3共同添加條件下，進(jìn)行批次發(fā)酵，研究Zn2+和Ca2+添加對(duì)ABE 發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果表明，向培養(yǎng)基中添加0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3能夠促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)酵至28h 時(shí)菌體最大生長(zhǎng)濃度OD620為5.43，與單獨(dú)添加Zn2+或Ca2+相比分別提高23.41%和 8.17%，至48h 葡萄糖基本消耗殆盡，殘?zhí)菨舛葹?.51g/L，發(fā)酵體系氧化還原電位（ORP）在發(fā)酵8h 迅速下降至-517mV，此后在發(fā)酵至48h的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定在-560～-550mV，在此過(guò)程中丁醇及總?cè)軇┏尸F(xiàn)快速累積狀態(tài)，丁醇及總?cè)軇┳罡弋a(chǎn)量分別達(dá)到14.41g/L 和23.69g/L，與單獨(dú)添加Zn2+相比提高14.64%和13.68%，與單獨(dú)添加Ca2+相比略有提高，丁醇的比生成速率達(dá)到0.23g/(g·h)；發(fā)酵終點(diǎn)乙酸和丁酸濃度為2.33g/L 和1.02g/L，乙酸濃度與單獨(dú)添加Zn2+或Ca2+相比有所降低，而丁酸濃度與單獨(dú)添加Zn2+相比提高49.02%，但與單獨(dú)添加Ca2+相比降低，表明Ca2+存在能夠增加有機(jī)酸積累，而Zn2+存在能夠有效降低有機(jī)酸積累。綜上所述，共同添加Zn2+和Ca2+能夠促進(jìn)底物糖吸收利用和菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，顯著降低發(fā)酵終點(diǎn)葡萄糖濃度，并進(jìn)一步提高ABE 發(fā)酵終點(diǎn)丁醇及總?cè)軇┑漠a(chǎn)量，發(fā)酵性能均優(yōu)于單獨(dú)添加Zn2+或Ca2+條件下的丙酮 丁醇發(fā)酵，即Zn2+和Ca2+對(duì)ABE 發(fā)酵存在顯著協(xié)同調(diào)控作用。

圖1 共同添加0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3 條件下的ABE 發(fā)酵

2.2 Zn2+和Ca2+存在條件下Mn2+對(duì)ABE發(fā)酵的 影響

已有研究發(fā)現(xiàn)Mn2+對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵酶存在調(diào)控作用[22]，為進(jìn)一步提高ABE 發(fā)酵丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量，在Zn2+和Ca2+添加條件下研究Mn2+對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖 2 所示。結(jié)果表明，不添加MnSO4·H2O 時(shí)，丁醇產(chǎn)量?jī)H為10.48g/L，與對(duì)照組（添加0.01g/L MnSO4·H2O）12.46g/L 相比降低1.98g/L，隨著MnSO4·H2O 添加濃度的升高，丁醇產(chǎn)量逐步提高，表明Mn2+的添加對(duì)丁醇產(chǎn)量有促進(jìn)作用，當(dāng)MnSO4·H2O 濃度達(dá)到0.8g/L 時(shí)，丁醇最高產(chǎn)量為13.48g/L，與對(duì)照組相比提高1.02g/L，繼續(xù)增大MnSO4·H2O 添加濃度，丁醇產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。MnSO4·H2O 濃度達(dá)到0.8g/L時(shí)，發(fā)酵液中乙酸和丁酸濃度分別為0.25g/L 和3.03g/L，與對(duì)照組相比分別降低了 0.56g/L 和0.78g/L。以上研究結(jié)果表明在Zn2+和Ca2+同時(shí)存在基礎(chǔ)上，再添加0.8g/L MnSO4·H2O 能夠進(jìn)一步提高丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量，并降低發(fā)酵終點(diǎn)有機(jī)酸副產(chǎn)物濃度。

圖2 Zn2+和Ca2+存在條件下MnSO4·H2O單因素發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)

2.3 添加Zn2+、Ca2+和Mn2+批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為探究共同添加Zn2+、Ca2+和Mn2+對(duì)ABE 發(fā)酵過(guò)程的協(xié)同調(diào)控作用，在0.001g/L ZnSO4·7H2O、4.0g/L CaCO3和0.8g/L MnSO4·H2O 共同添加條件下進(jìn)行了ABE 批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖 3 所示。發(fā)酵至48h 葡萄糖基本消耗殆盡，發(fā)酵終點(diǎn)葡萄糖濃度為2.56g/L，底物葡萄糖基本消耗殆盡。至26h最大菌體生長(zhǎng)濃度OD620為3.47，與同時(shí)添加Zn2+和Ca2+條件相比降低1.96，ORP 在發(fā)酵前8h 迅速下降至-524mV，此后在發(fā)酵至54h 的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定在-560～-550mV，在此過(guò)程中丁醇及總?cè)軇┛焖倮鄯e，ORP 在54h 開(kāi)始回升，ORP 相對(duì)于同時(shí)添加Zn2+和Ca2+條件維持在更低水平，表明發(fā)酵體系中 有機(jī)酸積累得到緩解，丁醇及總?cè)軇┐x合成旺盛，最終丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到 14.56g/L 和23.70g/L，丁醇的比生成速率達(dá)到0.48g/(g·h)，與同時(shí)添加Zn2+和Ca2+條件相比提高了108.69%，表明Zn2+、Ca2+和Mn2+的添加有效提高了菌體細(xì)胞代謝合成丁醇的能力。此外，發(fā)酵終點(diǎn)乙酸和丁酸濃度為1.99g/L 和0.54g/L，與同時(shí)添加Zn2+和Ca2+條件相比分別降低14.59%和47.06%，顯著緩解了發(fā)酵終點(diǎn)有機(jī)酸積累現(xiàn)象。綜上所述，金屬離子Zn2+、Ca2+和Mn2+的添加對(duì)ABE 發(fā)酵存在正向協(xié)同調(diào)控作用，能夠有效促進(jìn)有機(jī)酸重吸收，最終解決發(fā)酵終點(diǎn)有機(jī)酸副產(chǎn)物積累過(guò)多問(wèn)題。

圖3 Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在條件下的ABE 發(fā)酵

2.4 Zn2+、Ca2+和Mn2+協(xié)同調(diào)控作用對(duì)丁酸代謝的影響

本研究發(fā)現(xiàn)Zn2+、Ca2+和Mn2+的協(xié)同調(diào)控作用可以促進(jìn)ABE 發(fā)酵過(guò)程丁酸重吸收作用，顯著降低發(fā)酵終點(diǎn)丁酸濃度，由此在初始培養(yǎng)基和Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在條件下添加丁酸進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1 所示。結(jié)果表明，Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在條件發(fā)酵終點(diǎn)葡萄糖殘余濃度隨著添加丁酸增多逐漸增加，最大菌體生長(zhǎng)濃度OD620先增加后減少，當(dāng)添加1.9g/L 丁酸時(shí)OD620達(dá)到4.17，相比不添加丁酸條件提高20.17%，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)14.82g/L 和24.32g/L，與不添加丁酸條件相比略有提高。表明添加1.9g/L 丁酸能夠促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，提高丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量。

在相同濃度丁酸添加條件下，Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在條件發(fā)酵終點(diǎn)丁酸濃度均少于空白對(duì)照，說(shuō)明Zn2+、Ca2+和Mn2+同時(shí)存在能夠有效的增強(qiáng)ABE 發(fā)酵菌體丁酸重吸收代謝能力。隨著丁酸添加濃度的增加，乙酸生產(chǎn)得到增強(qiáng)，這可能是因?yàn)榫w生長(zhǎng)所需要的ATP 來(lái)自乙酰和丁酰磷酸化過(guò) 程[23-24]，1mol 葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙酸或丁酸分別可產(chǎn)生4mol 或3mol ATP[25]，少量丁酸添加會(huì)增強(qiáng)乙酰和丁酰磷酸化過(guò)程，對(duì)菌體生長(zhǎng)和溶劑生成有著促進(jìn)作用，然而過(guò)多的添加丁酸使得丁酰磷酸化受到抑制，菌體生長(zhǎng)所需ATP 只能由乙酰磷酸化過(guò)程提供，因此乙酸產(chǎn)量逐步增多，但菌體生長(zhǎng)所需ATP不足，從而抑制菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量減少。

表1 不同濃度丁酸添加條件下的ABE 發(fā)酵

因?yàn)槲唇怆x的分子態(tài)乙酸和丁酸能夠自由的穿過(guò)細(xì)胞膜，所以細(xì)胞內(nèi)乙酸和丁酸濃度等于細(xì)胞外分子態(tài)乙酸（UAA）和丁酸（UBA）濃度[26]。發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)記錄 pH 值，可根據(jù) Henderson- Hasselbalch 方程[13]計(jì)算出分子態(tài)乙酸和丁酸濃度。如圖 4 所示，在Zn2+、Ca2+和Mn2+同時(shí)存在條件下，隨著所添加丁酸濃度的提高（1.9g/L、3.8g/L 和5.6g/L），發(fā)酵過(guò)程中分子態(tài)乙酸和丁酸濃度相應(yīng)增加，而當(dāng)添加丁酸濃度提高至7.5g/L 時(shí)，分子態(tài)乙酸和丁酸濃度反而下降，總分子態(tài)有機(jī)酸最高濃度分別為41.26mmol/L、48.09mmol/L、55.64mmol/L和41.67mmol/L。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵體系中總分子態(tài)有機(jī)酸濃度超過(guò)57～60mmol/L 時(shí)，會(huì)出現(xiàn)菌體代謝停滯，殘余糖濃度較高，發(fā)酵提前終止的現(xiàn)象，即“酸崩潰”現(xiàn)象[26]，在本研究工作中，不同丁酸添加條件下總分子態(tài)有機(jī)酸濃度均低于上述 閾值，未發(fā)生“酸崩潰”的現(xiàn)象，因此發(fā)酵能夠順利 進(jìn)行。

圖4 不同濃度丁酸添加條件下分子態(tài)乙酸和分子態(tài)丁酸 過(guò)程變化

以上結(jié)果表明Zn2+、Ca2+和Mn2+同時(shí)存在能夠有效的增強(qiáng)ABE 發(fā)酵菌體丁酸重吸收代謝能力，少量丁酸添加條件下能夠提高菌體活性和丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量，并在較多丁酸添加條件下，能夠重吸收更多有機(jī)酸，從而保持一定菌體活性，避免“酸崩潰”的發(fā)生。

3 結(jié) 論

（1）ABE 發(fā)酵過(guò)程共同添加 0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3時(shí)，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到14.41g/L 和23.69g/L，與單獨(dú)添加Zn2+相比提高14.64%和13.68%，與單獨(dú)加Ca2+相比略有提高，發(fā)酵終點(diǎn)乙酸和丁酸濃度為2.33g/L 和1.02g/L，表明Ca2+存在能夠增加有機(jī)酸積累，而Zn2+存在能降低有機(jī)酸積累。

（2）ABE 發(fā)酵過(guò)程共同添加 0.001g/L ZnSO4·7H2O、4.0g/L CaCO3和0.8g/L MnSO4·H2O時(shí)，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到14.56g/L 和23.70g/L，丁醇比生成速率達(dá)到0.48g/(g·h)，相對(duì)于同時(shí)添加Zn2+和Ca2+條件的0.23g/(g·h)提高了108.69%，發(fā)酵終點(diǎn)乙酸和丁酸濃度為1.99g/L 和0.54g/L，與同時(shí)添加 Zn2+和 Ca2+條件相比分別降低 14.59%和47.06%，有效解決有機(jī)酸副產(chǎn)物積累過(guò)多問(wèn)題。

（3）在Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在條件下，添加1.9g/L 丁酸時(shí)，菌體最大生長(zhǎng)濃度OD620達(dá)到4.17，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到 14.82g/L 和24.32g/L，在發(fā)酵過(guò)程中，Zn2+、Ca2+和Mn2+的協(xié)同調(diào)控作用有效提高菌體細(xì)胞對(duì)丁酸的重吸收 能力。

綜上所述，Zn2+、Ca2+和Mn2+3 種金屬離子對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵存在顯著正向協(xié)同調(diào)控作用，有效提高菌體細(xì)胞代謝合成丁醇的能力，促進(jìn)有機(jī)酸，尤其是丁酸重吸收，降低發(fā)酵終點(diǎn)有機(jī)酸副產(chǎn)物的積累，最終提高丙酮丁醇發(fā)酵性能。優(yōu)化丙酮丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基中金屬元素組成是一種簡(jiǎn)單有效的過(guò)程優(yōu)化手段，為ABE 發(fā)酵法高效生產(chǎn)丁醇及總?cè)軇┨峁┝酥匾獏⒖己图夹g(shù)支持。

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