費氏丙酸菌的固定化方法及其發(fā)酵丙酸的工藝條件研究

馬志剛，王亞軍，王德培

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

費氏丙酸菌的固定化方法及其發(fā)酵丙酸的工藝條件研究

馬志剛，王亞軍，王德培

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

為提高丙酸發(fā)酵效率，進行了固定化費氏丙酸菌發(fā)酵丙酸的研究.采取吸附-包埋結合法，先以麩皮進行吸附，再用海藻酸鈉-聚乙烯醇進行包埋制備固定化細胞.通過正交實驗確定了固定化細胞的工藝條件：菌液與麩皮比例為5，mL∶0.6，g，吸附時間為15，min，包埋劑選用海藻酸鈉和聚乙烯醇混合物，質量比為3∶3，此條件下的包埋效率達到96.86%.初步研究了碳源及其質量濃度對固定化細胞生產丙酸的影響，確定了以乳酸鈉為碳源，質量濃度為40，g/L，丙酸產量可達13.75，g/L.

費氏丙酸菌；固定化；載體；丙酸；工藝條件

丙酸作為一種重要的大宗化學品，廣泛應用于各種工業(yè)生產中［1-3］.丙酸的生產方法有化學合成法和生物發(fā)酵法［4-7］，由于發(fā)酵法生產效率低、成本高［8］，目前，丙酸的工業(yè)化生產方法為化學合成法［9］.因此，如何提高生產效率是實現發(fā)酵法生產丙酸的技術關鍵.固定化丙酸菌是提高丙酸生產能力的有效方法之一［10］.

本文采用吸附-包埋結合法，根據前期實驗中通過對玉米芯粉、麩皮和米糠幾種吸附劑固定化細胞的穩(wěn)定性、包埋效率以及發(fā)酵丙酸能力的綜合考慮，選擇以麩皮作為吸附劑，然后采用兩種不同比例包埋劑，增強細胞固定效果，提高固定化細胞使用效率，從而提高丙酸生產能力.

1 材料與方法

1.1 菌種

費氏丙酸菌（Propionibacterium freudenreichii），本實驗室保存.

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸銨5，pH 7.2.

丙酸菌增殖培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸銨5，碳酸鈣3，pH 7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸銨5，碳酸鈣3，pH 7.2.

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 費氏丙酸菌的增殖培養(yǎng)

將活化好的菌株接到50，mL（250，mL三角瓶）增殖培養(yǎng)基中，接種量為2%，30，℃、180，r/min搖床培養(yǎng)20，h.

1.3.2 固定化費氏丙酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)

接種量為3%，裝液量為250，mL，磨口三角瓶裝液100，mL，發(fā)酵溫度30，℃，靜置培養(yǎng)72，h.

1.4 實驗方法

1.4.1 固定化菌體的制備

（1）菌懸液的制備：取已增殖培養(yǎng)的丙酸菌液200，mL放入離心杯中，18，000，r/min離心10，min，去除上清液，再加入生理鹽水搖勻，然后離心洗滌2次.加入60，mL無菌水搖勻制成菌懸液.

（2）包埋劑的制備：按比例稱取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（CA），加入15，mL去離子水加熱溶化，攪拌至充分混合，封口，放置到滅菌鍋中，115，℃滅菌20，min.

（3）交聯劑的制備：稱取一定量的硼酸、無水氯化鈣按比例溶于水中，配成30，g/L的氯化鈣溶液以及30，g/L氯化鈣和30，g/L硼酸的混合溶液.

（4）固定化凝膠菌球的成型：按比例向5，mL菌懸液中加入0.6，g吸附劑（麩皮），混勻，吸附10，min，然后將配好的包埋劑倒入上述混合液中，混勻，利用注射器吸取并滴入到交聯劑溶液中，形成菌球.

（5）交聯：將該菌球交聯24，h，用生理鹽水沖洗，然后轉到生理鹽水中，置于4，℃冰箱保存.

1.4.2 包埋劑比例及交聯劑的確定

選擇海藻酸鈉和聚乙烯醇作為包埋劑，CA與PVA質量比（g∶g）分別為：3∶8、3∶6、3∶4、2∶8、2∶6、2∶4，總體積20，mL.

選擇30，g/L氯化鈣、30，g/L硼酸的混合溶液和單獨的30，g/L氯化鈣溶液作為交聯劑制備固定化菌球，觀察球體狀況.

1.4.3 正交實驗確定固定化菌體制備條件

正交實驗因素及水平見表1.

表1 正交實驗因素水平表Tab. 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.4.4 碳源對固定化丙酸菌產丙酸的影響

分別以葡萄糖和乳酸鈉為碳源進行丙酸發(fā)酵，測定丙酸含量，計算丙酸轉化率.

1.5 分析方法

1.5.1 包埋效率的計算

總活菌數：采用10，μL微量菌落計數法.

菌球表面游離與洗脫菌數：將制好的菌球加入生理鹽水沖洗，洗液作活菌計數.

包埋效率=（總菌數-游離與洗脫菌數之和）/總活菌數×100%

1.5.2 丙酸菌代謝產物丙酸的測定

參見文獻［11］.

2 結果與討論

2.1 包埋劑比例及交聯劑的確定

不同包埋劑比例、不同交聯劑固定化后的實驗結果見表2.對于不同包埋劑比例，以30，g/L氯化鈣為交聯劑固定化后的菌球狀況均優(yōu)于30，g/L氯化鈣和30，g/L硼酸混合溶液作為交聯劑的菌球狀況，因此選擇30，g/L氯化鈣溶液為交聯劑；對于CA與PVA質量比分別為3∶4和2∶4的包埋劑，成球較好.

表2 不同包埋劑比例、不同交聯劑固定化后的菌球狀況Tab. 2 Immobilized test result of different ratio of entrapping agent to cross-linking agent

2.2 正交實驗確定固定化菌體制備條件

正交實驗結果及極差分析、方差分析分別見表3和表4.

表3 正交實驗結果及極差分析Tab. 3 Analysis of orthogon al design result and range

表4 正交實驗方差分析Tab. 4 Analysis of orthogonal design variance

根據正交實驗結果可確定固定化細胞發(fā)酵丙酸的最佳工藝條件為：菌液與麩皮比例為5，mL∶0.6，g，包埋劑的CA與PVA質量比為3∶3，吸附時間為15，min，此時的包埋效率為96.86%.

根據方差分析結果，比較各因素對發(fā)酵丙酸產量的影響可知，影響最顯著的是吸附時間，其次是包埋劑比例，影響最小的是菌液與吸附劑的比例.

2.3 碳源對固定化丙酸菌產丙酸的影響

2.3.1 葡萄糖質量濃度對丙酸菌發(fā)酵的影響

不同質量濃度葡萄糖為碳源時費氏丙酸菌的丙酸生產曲線見圖1.從圖1可以看出：發(fā)酵8，h，各質量濃度葡萄糖為碳源的丙酸產生速率均較快，丙酸產生速率分別為0.98、0.78、0.53、0.54，g/（L·h）；隨著發(fā)酵時間的增加，較低質量濃度葡萄糖為碳源的產酸速率大于高質量濃度的葡萄糖，并逐漸趨于平緩，這是因為酸的產生抑制了丙酸菌的發(fā)酵［12］.同時可以看出：葡萄糖（底物）質量濃度越高，對丙酸菌的抑制作用越強，底物的利用率越低；以40，g/L葡萄糖為碳源，發(fā)酵56，h丙酸產量達到最大值.

圖1 葡萄糖為碳源時費氏丙酸菌的丙酸生產曲線Fig. 1Propionic acid production by P. freudenreichii with glucose as the carbon source

不同質量濃度葡萄糖為底物時的丙酸轉化率見表5.從圖1和表5可以看出：60、80，g/L葡萄糖質量濃度的丙酸轉化率低，發(fā)酵效果不理想；20、40，g/L葡萄糖為底物的丙酸產量（丙酸產量=葡萄糖質量濃度×丙酸轉化率）分別為10.62、11.28，g/L.可見，雖然與20，g/L葡萄糖為底物的丙酸轉化率（53.10%）相比，40，g/L的丙酸轉化率相對較低（28.19%），但其丙酸產量較高，是較適合的底物濃度.

表5 葡萄糖為底物時丙酸轉化率Tab. 5 Analysis of production data with glucose as the substrate

2.3.2 乳酸鈉質量濃度對丙酸菌發(fā)酵的影響

不同質量濃度乳酸鈉為碳源時費氏丙酸菌的丙酸生產曲線見圖2.從圖2可以看出：發(fā)酵8，h，以40，g/L乳酸鈉為碳源時丙酸產生速率較快；發(fā)酵到32，h時，以20、40、60，g/L乳酸鈉為碳源的丙酸產生速率趨于平穩(wěn)，分別為0.28、0.29、0.25，g/（L·h）；隨著時間的增加，以40，g/L乳酸鈉為碳源的產酸速率高于其他濃度，發(fā)酵64，h丙酸產量達到最大值.

圖2 乳酸鈉為碳源時費氏丙酸菌的丙酸生產曲線Fig. 2 Propionic acid production by P. freudenreichiiwith sodium lactate as the carbon source

不同質量濃度乳酸鈉為底物時的丙酸轉化率見表6.從圖2和表6可以看出：80，g/L乳酸鈉為底物的丙酸產量為4.41，g/L，丙酸轉化率為5.51%，丙酸產量和丙酸轉化率都很低；20、40、60，g/L乳酸鈉為底物的丙酸產量分別為10.49、13.75、10.04，g/L，都在10，g/L以上，但60，g/L乳酸鈉為底物的丙酸轉化率（16.74%）較低；另外，雖然與20，g/L乳酸鈉為底物的丙酸轉化率（52.44%）相比，40，g/L的丙酸轉化率相對較低（34.38%），但其丙酸產量（13.75，g/L）較高，是較適合的底物濃度.

表6 乳酸鈉為底物時的丙酸轉化率Tab. 6 Analysis of production data with sodium lactate as the substrate

從以上葡萄糖和乳酸鈉為碳源的實驗結果可以看出：發(fā)酵初期的碳源消耗較大，丙酸產生速率較高；隨后的發(fā)酵中，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵曲線相對平緩，以乳酸鈉為碳源的曲線呈梯度緩慢上升直至發(fā)酵中后期.出現此結果是因為，丙酸菌以葡萄糖和以乳酸鈉為碳源時代謝途徑不同，當以葡萄糖為單一碳源時，丙酸積累到一定濃度會對菌株生長和產酸產生反饋抑制，所以發(fā)酵8，h后丙酸濃度上升平緩.與40，g/L葡萄糖相比，40，g/L乳酸鈉的丙酸產量較高，為13.75，g/L，丙酸轉化率為34.38%，與Lewis 等［12］的結論一致.

3 結 論

本文通過實驗確定了先以麩皮進行吸附，再用海藻酸鈉-聚乙烯醇進行包埋的方法制備固定化細胞.確定了固定化細胞的工藝條件：菌液與麩皮比例為5，mL∶0.6，g，吸附時間為15，min，包埋劑的海藻酸鈉與聚乙烯醇質量比為3∶3，此條件下的包埋效率為96.86%.

分別以葡萄糖、乳酸鈉作為單一碳源，進行固定化丙酸菌發(fā)酵生產丙酸，相比40，g/L葡萄糖，40，g/L乳酸鈉丙酸產量高，達到13.75，g/L，丙酸轉化率也高，達到34.38%，是丙酸發(fā)酵較好的碳源.

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［12］ Lewis V P，Yang S T. Propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici：Effect of growth substrate［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，1992，37（4）：437-442.

責任編輯：常濤

Immobilization of Propionibacterium freudenreichii and the Processing Condition of its Propionic Acid Fermentation

MA Zhigang，WANG Yajun，WANG Depei
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

In order to improve the efficiency of propionic acid fermentation，propionicacid fermentation with immobilized Propionibacterium freudenreichii were investigated. Adsorption-entrapping method was used to prepare immobilized cells with bran as the adsorbent and CA-PVA as the entrapping material. Through orthogonal experiment，the propionic acid immobilized cells' fermentation process conditions were determined. The proportion of bacterium solution to bran was 5，mL∶0.6 g，the adsorption time was 15，min，the entrapping agent was the mixture of CA and PVA，the mass ratio was 3∶3. Under this immobilization conditions，the encapsulation efficiency reached 96.86%. The effect of the carbon sources and their concentration on propionic acid production were investigated. The experimental results showed that the sodium lactate was a better carbon source.When the sodium lactate concentration was 40，g/L，the yield of propionic acid reached 13.75，g/L.

Propionibacterium freudenreichii；immobilization；carrier；propionic acid；process condition

Q93 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0025-04

10.13364/j.issn.1672-6510.20130176

2013-12-26；

2014-08-11

馬志剛（1981—），男，河北人，碩士研究生；通信作者：王德培，教授，wangdp@tust.edu.cn.