旋覆歸連方醇提液鎮(zhèn)痛抗感染作用的實驗研究

高小玲，崔姍姍，汪保英，王慧慧，陳玉龍

旋覆歸連方是本課題組結合大量食管癌相關文獻和應用抗腫瘤體外模型進行藥物篩選，立足于理氣祛痰、活血化瘀、清熱解毒的治療原則，將多法合于一方總結出來的［1-3］。方中旋覆花具有降氣止嘔、消痰散結、通利血脈之功效，在本方中作為君藥;當歸具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便、下氣止咳之作用［4-5］;黃連具有瀉火解毒、清熱燥濕之功能［6］。三藥配合，共湊降氣化痰活瘀、清熱解毒散結、抑瘤生長之功能。本課題組前期的實驗結果表明，該方能夠明顯抑制食管癌細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的生長，并能夠阻滯腫瘤細胞周期，可將食管癌ECa9706細胞周期阻滯在G0/G1期［7］。疼痛、炎性增生等是腫瘤患者的常見癥狀。為了探討旋覆歸連方的藥理作用，為臨床應用提供理論依據(jù)，本實驗觀察旋覆歸連方醇提液鎮(zhèn)痛及抗感染作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 昆明小鼠240只，SPF級，6～8周齡，雌150只、雄90只，體質量18～22 g，購自山東魯抗醫(yī)藥集團有限公司，許可證號:SCXK(魯)20130001，在河南中醫(yī)學院SPF級動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 試驗藥物 旋覆花、當歸、黃連購自河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，由本實驗室提取有效部位并按旋覆花∶當歸∶黃連=9∶6∶5比例，加入10倍85%乙醇，1周后取藥液，過濾，旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，所得浸膏充分蒸發(fā)水分后稱重。實驗時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成所需濃度。阿司匹林:西安利君制藥有限責任公司生產(chǎn)，國藥準字H61021710;醋酸地塞米松片:浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號140301。

1.3 熱板致痛作用 雌性小鼠置于 (55.0±0.5)℃智能熱板儀中，自投入熱板至出現(xiàn)舔后足時間為其痛閾，取痛閾為5～30 s的小鼠60只，采用隨機數(shù)字表法分為5組，空白對照組(羧甲基纖維素鈉)、阿司匹林組 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。測定正常痛閾后，各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d。于給藥前和末次給藥后30 min、1 h、2 h分別測小鼠痛閾1次［8］。

1.4 冰乙酸致痛作用 剩余小鼠隨機選取60只，雌雄各半，采用隨機數(shù)字表法分為5組，空白對照組 (羧甲基纖維素鈉)、阿司匹林組 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d，末次給藥后1 h腹腔注射0.6%冰乙酸氯化鈉溶液0.2 ml，記錄20 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)［5］。

1.5 耳郭二甲苯致炎作用 剩余小鼠隨機選取60只，雌雄各半，采用隨機數(shù)字表法分為5組，空白對照組 (羧甲基纖維素鈉)、地塞米松組 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d，最后1次于實驗前1 h灌胃。實驗時將60 μl二甲苯均勻涂于小鼠右耳兩面致炎，左耳做對照，20 min后處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器將小鼠雙耳同部位等面積切下，用電子天平稱重，以左右耳質量之差為耳郭腫脹度［9］。

1.6 肉芽腫組織凈質量 剩余小鼠60只，雌雄各半。采用10%水合氯醛0.38 g/kg腹腔注射麻醉，左右腋窩各放入質量為10 mg的經(jīng)高壓滅菌棉球，縫合切口。術后第2天，采用隨機數(shù)字表法分為5組，空白對照組 (羧甲基纖維素鈉)、地塞米松組 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆歸連方低劑量組(旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組連續(xù)灌胃8 d后處死小鼠，取出兩側的棉球及肉芽腫組織，于80℃烘箱烘2 h，取出棉球后稱重，除以2即為一側平均肉芽腫組織質量，此質量與植入時棉球質量之差即為肉芽腫組織凈質量［9］。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，不同時間痛閾比較采用兩因素重復測量方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠不同時間痛閾比較 痛閾治療方法與時間無交互作用 (P＞0.05);組間痛閾比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);不同時間痛閾比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 5組小鼠扭體次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。與空白對照組比較，阿司匹林組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);與阿司匹林組比較，旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);與旋覆歸連方中劑量組比較，旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 各組小鼠不同時間痛閾比較 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

表1 各組小鼠不同時間痛閾比較 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

注:○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○ 給藥前 給藥后30 min給藥后1 h 給藥后12 18.8 ±4.6 20.3 ±5.3 17.2 ±7.6 24.0 ±8.2阿司匹林組 10 18.2 ±5.2 21.5 ±6.4 27.1 ±5.3 35.2 ±8.9旋覆歸連方低劑量組 11 17.3 ±6.8 24.4 ±5.0 23.5 ±6.7 28.6 ±8.7旋覆歸連方中劑量組 12 16.8 ±4.2 18.4 ±4.4 28.5 ±7.0 22.6 ±7.5旋覆歸連方高劑量組 11 16.4 ±4.2 18.4 ±6.1 19.0 ±5.4 26.2 ±9.0 F 2 h空白對照組值=0.001 F交互 =1.212，F(xiàn)組間 =1.062，F(xiàn)時間 =4.759 P 值 P交互 =0.283，P組間 =0.388，P時間

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與阿司匹林組比較，△P＜0.05;與旋覆歸連方中劑量組比較，▲P＜0.05;○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○ 扭體次數(shù)12 30.8 ±7.3阿司匹林組 11 2.2 ±1.0*旋覆歸連方低劑量組 11 13.3 ±6.0＊△旋覆歸連方中劑量組 12 17.3 ±4.0＊△旋覆歸連方高劑量組 12 9.1 ±3.4＊△▲F空白對照組＜0.001 55.850 P值值

2.3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 5組小鼠耳郭腫脹度比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。地塞米松組耳郭腫脹度較空白對照組減輕，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);空白對照組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠耳郭腫脹度比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表3)。

表3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

表3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

注:與空白對照組比較，*P＜0.05

12 17.2 ±6.2地塞米松組 12 9.1 ±4.2*旋覆歸連方低劑量組 12 11.6 ±5.7旋覆歸連方中劑量組 12 14.9 ±6.5旋覆歸連方高劑量組 12 14.2 ±6.4 F組別 只數(shù) 腫脹度空白對照組2.710 P值值0.039

2.4 各組小鼠肉芽腫組織凈質量比較 5組小鼠肉芽腫組織凈質量比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。與空白對照組比較，地塞米松組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠肉芽腫組織凈質量減少，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);地塞米松組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠肉芽腫組織凈質量比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表4)。

表4 各組小鼠肉芽腫組織凈質量比較 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

表4 各組小鼠肉芽腫組織凈質量比較 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○10 30.1 ±11.2地塞米松組 10 17.4 ± 6.5*旋覆歸連方低劑量組 10 19.4± 7.8*旋覆歸連方中劑量組 9 18.0± 7.0*旋覆歸連方高劑量組 10 18.4± 6.6*F肉芽腫凈質量空白對照組4.370 P值值0.005

3 討論

炎癥為常見病理變化，疼痛是炎癥的常見癥狀，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素。旋覆花的活性內(nèi)酯具有抗感染、抗腫瘤等藥理作用［10］，當歸有效成分揮發(fā)油、有機酸、碳水化合物、氨基酸以及黃連主要成分黃連素等，在炎癥、腫瘤以及疼痛研究中療效肯定［11-12］。旋覆歸連方是本課題組經(jīng)過對腫瘤細胞的篩選及基于中藥理論所組的方劑，并已取得國家發(fā)明專利 (專利號:ZL201210131821.X)。細胞實驗研究表明，旋覆歸連方85%醇提液所得提取物對食管癌細胞的抑制作用比較穩(wěn)定［13］。本實驗從鎮(zhèn)痛、抗感染方面考察旋覆歸連方醇提液的作用，為該方體外應用提供了基礎。

本研究結果表明，不同時間間痛閾比較有差異。由于熱板反復檢測小鼠痛閾，小鼠短時間內(nèi)容易產(chǎn)生適應性，因此組內(nèi)結果差異不大，而阿司匹林組在此實驗中，結果也不明顯，可能因為阿司匹林更適于慢性鈍痛。旋覆歸連方醇提液可減少冰乙酸所致小鼠扭體次數(shù)，表明旋覆歸連方對冰乙酸所致慢性鈍痛有一定的作用。旋覆歸連方醇提液可降低小鼠皮下包埋棉球引起的慢性肉芽腫反應，與食管癌臨床治療的適應證相符，表明該方具有良好的抗感染作用。值得注意的是其對慢性肉芽腫治療作用明顯，旋覆歸連方低劑量組與地塞米松組無差異。

慢性肉芽腫主要病理成分為上皮細胞和巨噬細胞，血管生成明顯，且白介素 (IL)-8高表達并發(fā)揮重要病理作用。IL-8是影響反流性胃食管疾病中食管上皮遷移、纖維化和癌變的重要炎性遞質［14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，旋覆歸連方對細胞周期信號通路相關基因、蛋白激酶 (AKT1)、核因子(NF)-κB、絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK)-9及多個炎癥相關基因表達具有很好的抑制作用，其中用藥組IL-8表達明顯下降［13］。IL-8及其受體在食管鱗癌患者血清及組織中呈高表達，并與腫瘤分期、預后，特別是淋巴和遠端轉移密切相關，可以作為預測腫瘤結果和選擇相應治療方法的潛在標志物［15-16］。

綜上所述，腫瘤與慢性炎癥關系密切，本實驗旋覆歸連方醇提液鎮(zhèn)痛和抗感染療效顯著，該方是否通過IL-8信號調(diào)控腫瘤細胞與其微環(huán)境而起到止痛抗感染及抗腫瘤作用，將在下一步進行研究。

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