miR-181b-5p在人卡波西肉瘤組織中的表達(dá)變化及臨床意義

丁 媛，吳秀娟，康曉靜，普雄明

本研究創(chuàng)新點(diǎn):

國(guó)內(nèi)外現(xiàn)還未有關(guān)于miR-181b-5p與卡波西肉瘤發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究。本研究通過(guò)研究miR-181b-5p在人卡波西肉瘤組織中的表達(dá)變化及其臨床意義，為本病的基因診斷及藥物靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)，也對(duì)miR-181b-5p在卡波西肉瘤中發(fā)病機(jī)制的深入研究具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解mRNA，發(fā)揮對(duì)約30%人類(lèi)蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名超過(guò)9 500個(gè)miRNA，分別參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)環(huán)節(jié)，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、病毒學(xué)以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)有了許多成熟的研究［1］。雖然卡波西肉瘤 (Kaposi's sarcoma，KS)組織來(lái)源不清，但大多數(shù)研究結(jié)果還是認(rèn)為，KS細(xì)胞主要來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞，腫瘤組織中可能還存在某種必要的細(xì)胞產(chǎn)物以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)［2］。而有研究表明，miR-181b通過(guò)調(diào)控核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路作用于靶基因核蛋白α3［3］，最終參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的過(guò)程。miR-181b-5p是從miR-181b的前體5'端加工而來(lái)。miR-181b-5p是否通過(guò)復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究檢測(cè)miR-181b-5p在人KS組織中的表達(dá)，明確miR-181b-5p是否與KS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 收集2012年1月—2013年10月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院18例行HE染色且病理檢查明確診斷KS患者的KS組織及癌旁組織 (活檢取材)，存于液氮罐中。

1.2 主要試劑 miRNeasy Mini Kit試劑盒 (德國(guó)Qiagen公司)，Trizol試劑 (美國(guó)Invitrogen公司)，RNA酶抑制劑、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 (美國(guó)Epicentre公司)，10×反轉(zhuǎn)錄 (RT)緩沖液、2×PCR Master Mix(美國(guó)Super Array公司)，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合液 (芬蘭HyTest Ltd公司)，RT引物 (上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 提取組織總RNA(含miRNA) 取液氮保存的KS組織及癌旁組織 (50 mg)，按miRNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。采用紫外線吸收法檢測(cè)RNA的濃度及純度，OD260/OD280比值在1.8～2.2之間的用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RT-RNA 選取 2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μl、10 × RT 緩沖液 2 μl、RT 引物 (1 μmol/L)0.3 μl、總RNA 700 ng、MMLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 (200 U/μl)0.2 μl、RNA 酶抑制劑 (40 U/μl)0.3 μl，加去 RNA 酶水至20 μl，制成RT混合反應(yīng)液。采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RT-RNA:16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min，合成的cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。RT引物:hsa-miR-181b:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCACCG -3';U6:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)使用ViiA 7 Real-time PCR系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:2 × PCR Master Mix 5 μl、10 μmol/L PCR 特異引物:上游引物 0.5 μl、下游引物 0.5 μl，加水至總體積為8 μl，輕彈管底將溶液混合，以5 000 r/min離心1 min(離心半徑10 cm)。將8 μl混合液加到384孔PCR板對(duì)應(yīng)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的cDNA 2 μl，小心粘上Sealing Film封口膜，并以5 000 r/min離心1 min(離心半徑10 cm)。U6和各樣品的目的miRNA均按以下程序進(jìn)行:95℃ 10 min，共40個(gè) PCR循環(huán)〔95℃ 10 s，60℃ 60 s(收集熒光)〕。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動(dòng)進(jìn)行，升溫速率為0.05℃/s)，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。得到基本循環(huán)數(shù) (Ct)值，以U6為內(nèi)參，△Ct=Ct與內(nèi)參循環(huán)數(shù)差值，△△Ct=最低樣本△Ct值 -其他各樣本△Ct值，目的基因相對(duì)含量=2-△△Ct。hsa-miR-181b-5p PCR 特異引物的上游引物為:5'-GGGAACATTCATTGCTG-3'，下游引物為:5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'。U6 PCR特異引物的上游引物為:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物為:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.4 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn) KS組織病理分期［4］:(1)斑片期:無(wú)增生的梭形細(xì)胞和血管成分，真皮內(nèi)血管增生擴(kuò)張，傾向于形成新生血管，非特異性改變;(2)斑塊期:少量血管成分，梭形細(xì)胞逐漸增多;(3)結(jié)節(jié)期:梭形細(xì)胞明顯密集。全身皮損類(lèi)型［5］:斑片、斑塊、結(jié)節(jié)、糜爛、水腫。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 患者均為維吾爾族，其中男17例，女1例;年齡29～79歲，平均 (60.0±14.1)歲;病程1～132個(gè)月，平均 (24.2±33.8)個(gè)月;KS組織病理分期:斑片期5例，斑塊期5例，結(jié)節(jié)期8例;全身皮損面積:≤1%6例，＞1%12例;全身皮損類(lèi)型≤2種7例，＞2種11例;人皰疹病毒8型 (HHV-8)陽(yáng)性15例，陰性3例;人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV)陽(yáng)性7例，陰性11例;HIV合并HHV-8雙陽(yáng)性6例，雙陰性2例。

2.2 KS組織和癌旁組織中miR-181b-5p表達(dá)水平KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.73 ±0.40)，癌旁組織中miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.24±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.826，P＜0.01)。

2.3 miR-181b-5p表達(dá)水平的單因素分析 不同年齡、病程、全身皮損面積、全身皮損類(lèi)型及HHV-8、HIV陰陽(yáng)性患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。不同腫瘤組織病理分期患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);斑塊期、結(jié)節(jié)期患者miR-181b-5p表達(dá)水平高于斑片期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表1)。HIV合并HHV-8雙陽(yáng)性患者miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.32 ±0.19)，HIV 合并HHV-8雙陰性患者miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.43±0.17)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.615，P=0.158)。

3 討論

由于獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS)合并KS病死率高，且KS可以幫助早期診斷AIDS以及評(píng)估預(yù)后［6］，故其在AIDS的防治工作中發(fā)揮著巨大作用。現(xiàn)已證明，miR-181b在炎癥和惡性腫瘤中形成并建立了廣泛的聯(lián)系，miR-181b上游被STAT3和HMGA1轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)，其中STAT3通過(guò)白介素6(IL-6)激活的轉(zhuǎn)錄因子直接激活miR-181b，從而抑制腫瘤抑制基因PTEN和CYLD的功能，導(dǎo)致NF-κB活性增強(qiáng)后造成炎癥的發(fā)生，而miR-181b通過(guò)抑制下游靶基因CBX7參與調(diào)控細(xì)胞周期，通過(guò)P27、BCL2等靶基因影響腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和凋亡［7］;近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用［8］。研究顯示，miR-181b表達(dá)水平在結(jié)腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、甲狀腺癌、口腔癌、骨肉瘤、急性髓細(xì)胞性白血病、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中上調(diào)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、胃癌、肺癌、前列腺癌中下調(diào)［8］，以上結(jié)果均提示miR-181b的功能較為獨(dú)特，其表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)取決于腫瘤的類(lèi)型和與之對(duì)立的細(xì)胞種類(lèi);miR-181b還參與了各種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)［8］。國(guó)內(nèi)、外少見(jiàn)KS與人miRNA的報(bào)道，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KS組織中miR-181b-5p的 表 達(dá) 水 平，結(jié) 果 顯 示，miR-181b-5p在KS組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，表明其與KS的發(fā)生發(fā)展可能存在著密切關(guān)系，提示miR-181b-5p對(duì)于KS來(lái)說(shuō)可能是一種致瘤基因。

表1 miRNA-181b-5p表達(dá)的影響因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

表1 miRNA-181b-5p表達(dá)的影響因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

注:*為F值;與斑片期比較，△P＜0.05;HHV-8=人皰疹病毒8型，HIV=人類(lèi)免疫缺陷病毒

因素 例數(shù) miRNA-181b-5p表達(dá)水平 t(F)值 P值年齡(歲)11 0.83 ±0.40 1.739 0.101≥60 10 0.59 ±0.39＜60 8 0.91 ±0.37病程(月) 0.816 0.427≤6 6 0.84 ±0.44＞6 12 0.68 ±0.39腫瘤組織病理分期 4.181* 0.036斑片期 5 0.37 ±0.22斑塊期 5 0.96 ±0.40△結(jié)節(jié)期 8 0.82 ±0.37△全身皮損面積(%) 0.504 0.621≤1 6 0.80 ±0.42＞1 12 0.70 ±0.41全身皮損類(lèi)型(種) 0.425 0.677≤2 7 0.78 ±0.43＞2 11 0.70 ±0.41 HHV-8 1.392 0.183陽(yáng)性 15 0.41 ±0.11陰性 3 0.25 ±0.14 HIV 0.834 0.416陽(yáng)性 7 0.67 ±0.41陰性

本研究結(jié)果顯示，不同年齡、病程、全身皮損面積、全身皮損類(lèi)型及HHV-8、HIV陰陽(yáng)性患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平無(wú)差異。有研究報(bào)道，HHV-8和HIV雙重感染可增加KS的發(fā)生率，雙重感染患者病死率較單純感染患者明顯提高［9］，提示雙重感染患者病情可能較重，miRNA-181b-5p在腫瘤組織中高表達(dá)。而本研究結(jié)果顯示，HIV合并HHV-8雙陽(yáng)性患者miR-181b-5p表達(dá)水平與HIV合并HHV-8雙陰性患者無(wú)差異，可能和本研究臨床病例數(shù)較少有關(guān)。

Lu等［10］認(rèn)為，miRNA表達(dá)譜可以作為腫瘤組織分型的依據(jù)，還可以作為細(xì)胞分化程度的客觀評(píng)價(jià)，從而得出miRNA可能參與了細(xì)胞分化狀態(tài)的結(jié)論。通過(guò)對(duì)腫瘤組織和正常組織間細(xì)胞分化程度的對(duì)比，建立與之對(duì)應(yīng)的腫瘤miRNA標(biāo)簽或miRNA表達(dá)譜，對(duì)于腫瘤的早期診斷和靶向治療有積極推動(dòng)作用。Heffelfinger等［11］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)miRNA的表達(dá)水平可以對(duì)8例浸潤(rùn)型基底細(xì)胞癌患者中的7例進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)，沒(méi)有準(zhǔn)確分型的1例患者為混合型基底細(xì)胞癌。尤其是miR-183的表達(dá)水平在浸潤(rùn)型基底細(xì)胞癌中明顯低于結(jié)節(jié)型基底細(xì)胞癌，進(jìn)一步證明其可抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Santucci等［12］認(rèn)為，KS和其他皮膚腫瘤 (如蕈樣肉芽腫)一樣，分為斑片期、斑塊期和結(jié)節(jié)期，臨床上表現(xiàn)為一個(gè)連續(xù)發(fā)展的過(guò)程。在組織學(xué)上亦是如此，斑片期組織學(xué)以非特異性炎癥為主，而斑塊期和結(jié)節(jié)期則以增生的梭形細(xì)胞和血管瘤樣結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為主。本研究中，雖然斑塊期、結(jié)節(jié)期患者KS組織miR-181b-5p表達(dá)水平均高于斑片期，提示miR-181b-5p可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng);但結(jié)節(jié)期與斑塊期無(wú)差異，考慮和本研究病例數(shù)較少有關(guān)，也可能與miRNA-181b-5p不能完全體現(xiàn)KS譜性改變有關(guān)，故需要進(jìn)一步增加病例數(shù)后驗(yàn)證。

KS發(fā)病率相對(duì)較低，故本研究納入病例數(shù)較少，而且研究較為局限，未進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞學(xué)功能以及靶基因的深入研究，本研究組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證其是否可以完全體現(xiàn)KS的譜性改變，并進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，進(jìn)而驗(yàn)證其靶基因的功能，從而為臨床的診斷提供幫助，為探索KS特異性診斷和治療的新方法提供理論依據(jù)。

綜上所述，miRNA-181b-5p在KS組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且在斑片期損害中相對(duì)表達(dá)水平較低，表明其與KS的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系，miRNA-181b-5p有可能成為潛在的分子診斷及治療指標(biāo)之一。

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