臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的細胞機制研究

曹國慶，李秀華，武百山，倪家驤

臭氧可改善氧氣供應(yīng)，增強免疫，釋放血紅素氧合酶1(HO-1)、熱休克蛋白70(HSP-70)，產(chǎn)生超級紅細胞，釋放干細胞，上調(diào)抗氧化酶［1-2］。臭氧自體血治療是補充性的臨床治療方法，已應(yīng)用于乙型肝炎、糖尿病、退行性眼病、不同疼痛綜合征和缺血性外周血管病的治療［3］。前期的臨床研究顯示，臭氧自體血治療可以有效緩解痛風(fēng)患者的疼痛，具有鎮(zhèn)痛作用，且患者耐受性良好、安全、沒有嚴重不良反應(yīng)［4］。本研究旨在觀察痛風(fēng)患者經(jīng)臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白水平及炎性細胞因子水平的改變，在細胞水平上研究探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例入選與排除標準 入選標準:符合2006年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟 (EULAR)診斷痛風(fēng)標準［4］，尿酸＞420 μmol/L;急性或慢性痛風(fēng)男性患者，年齡20～60歲;痛風(fēng)藥物治療效果不佳或產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng);藥物治療有禁忌證。排除標準:不同意臭氧自體血治療;患心理精神疾病;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G-6PD)明顯缺陷;嚴重的過敏體質(zhì);應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療;患甲狀腺功能亢進癥、血小板減少癥和嚴重心血管疾病;嚴重腎功能損害 (血漿肌酐清除率＜30 ml/min)。

1.2 一般資料 選擇2012年6月—2013年9月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院疼痛門診符合入選與排除標準的痛風(fēng)患者10例，均為男性，年齡 24～59歲，平均 (41.3±9.9)歲;疼痛性質(zhì)為觸痛、酸痛或脹痛?；颊呔M行非隨機、非盲開放研究，簽署書面知情同意書。患者治療前的一般資料見表1。

1.3 方法 入室后靜脈穿刺，連接輸血抗氧化管路，監(jiān)護儀監(jiān)測臭氧自體血治療流程:273 nm分光光度計準確測量臭氧濃度1～100 mg/L，相當于氧氣濃度0.1% ～5.0%;抗臭氧的負壓瓶內(nèi)含有3.8%枸櫞酸鈉20 ml，吸入200 ml靜脈血，將所設(shè)定濃度的臭氧注入負壓瓶與靜脈血充分混合后，再回輸體內(nèi);3次/周，共10次。其中臭氧由醫(yī)用氧氣 (100%)通過德國赫爾曼公司生產(chǎn)的臭氧發(fā)生器產(chǎn)生;混合氣體中臭氧的濃度為20 mg/L。

分別采集患者治療前、第5次治療后和第10次治療后的靜脈血5 ml。血液靜止2 h后以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為3 cm)，取血清備用，樣品在-80℃條件下儲存。采用免疫比濁法檢測血清IgA、IgM、IgG和補體C3、C4水平;采用流式細胞微球陣列分析方法 (CBA)檢測患者IL-8、IL-12和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以 (±s)表示，采用單因素重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 10例患者有9例完成全部治療，1例由于交通原因完成7次治療。在臭氧自體血治療后，1例患者的 HBeAb和 HBsAb、1例患者的類風(fēng)濕因子(RF)、1例患者的抗胰島素抗體 (ISN-Ab)均由陽性變?yōu)殛幮浴?/p>

2.2 患者臭氧自體血治療前后免疫球蛋白及補體水平的變化 患者治療前、第5次治療后和第10次治療后IgA、IgM、IgG和補體C3、C4水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 患者臭氧自體血治療前后炎性細胞因子水平的變化 患者治療前后IL-12、MCP-1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);患者治療前后IL-8水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)?；颊叩?次治療后和第10次治療后IL-8水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。

3 討論

痛風(fēng)是因嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄障礙致血尿酸水平升高的一組異質(zhì)性疾病，高尿酸血癥是痛風(fēng)的危險因素［5-7］。目前，主要治療策略仍為控制急性發(fā)作、控制高尿酸血癥形成晶體，因此痛風(fēng)治療非常有限［8-11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭氧自體血治療后炎性細胞因子IL-8水平下降，提示IL-8可能在痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

表1 痛風(fēng)患者治療前的一般資料Table 1 General information of gouty patients before treatment

表2 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

表2 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

時間 例數(shù) IgA IgM IgG C3 C 4.37 ±0.29第 5 次治療后 9 2.87 ±1.34 1.19 ±0.20 10.94 ±3.29 1.65 ±0.33 0.34 ±0.10第10 次治療后 9 2.76 ±1.27 1.21 ±0.11 10.87 ±3.06 1.51 ±0.18 0.32 ±0.09 F治療前 9 2.96 ±1.31 1.00 ±0.15 10.80 ±2.65 1.68 ±0.44 0 0.39 0.22 3.25 0.86 0.15 P值值0.76 0.82 0.15 0.49 0.86

表3 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

表3 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

注:MCP-1=單核細胞趨化蛋白1;與治療前比較，*P＜0.05

時間 例數(shù)9 30.01 ±1.00 0.81 ±1.08 90.13 ±14.10第5 次治療后 9 15.36 ±0.62* 0.11 ±0.07 90.99 ±11.24第10 次治療后 9 10.36 ±0.61* 0.20 ±0.21 95.65 ±16.59 F IL-8 IL-12 MCP-1治療前14.73 1.40 1.22 P值值0.01 0.33 0.37

Kanevets等［12］發(fā)現(xiàn)，IgM抗體的F(ab')2片段與尿酸鈉 (MSU)晶體結(jié)合，IgM抗體在尿酸溶液中促進MSU晶體沉積，這種沉積作用依賴于IgM的完整結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，治療前后IgM水平無差異，可能的機制是血清IgM抗體可以被特異性識別，在晶體表面起到穩(wěn)定初始晶體核的作用。臭氧自體血治療后，1例患者的HBeAb和 HBsAb、1例患者的 RF、1例患者的ISN-Ab均由陽性變?yōu)殛幮浴？赡艿臋C制為痛風(fēng)患者自身免疫功能低下，臭氧激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生干擾素、IL、抗氧化酶，并可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生臍血細胞 (CTL)和自然殺傷細胞 (NK)，改善肝臟氧供，激活免疫系統(tǒng)的CD4+和CD8+細胞及自身免疫，從而抵御病毒，攻擊和殺死病毒。然而其確切機制還需進一步研究。

IL-8主要來源于單核細胞和吞噬細胞，主要的生物學(xué)活性是吸引和激活中性粒細胞，中性粒細胞與IL-8接觸后發(fā)生形態(tài)變化，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物;這些作用可導(dǎo)致機體局部的炎性反應(yīng)，達到殺菌和細胞損傷的目的［13］。IL-8參與單核細胞黏附力的粥樣硬化早期階段。IL-8獨特的功能特點是在急性炎癥部位t1/2相對較長。在炎性反應(yīng)早期產(chǎn)生，但是數(shù)天和數(shù)周甚至更長的時間仍有活性，這與其他許多炎性細胞因子在體內(nèi)幾小時內(nèi)產(chǎn)生和清除不同［14］。IL-8對氧化物高度敏感，抗氧化物明顯減少IL-8的表達［15］。IL-8和其他化學(xué)因子調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用是臭氧自體血治療痛風(fēng)的基礎(chǔ)，也成為未來潛在治療痛風(fēng)的目標。

在家兔急性痛風(fēng)實驗?zāi)Ｐ蜕螹SU晶體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，注入MSU晶體到膝關(guān)節(jié)引起明顯腫脹，觀察滑膜和滑膜液中性粒細胞滲透情況，注射后12～24 h在滑膜襯里發(fā)現(xiàn)細胞免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)［16］。Dje N'Guessan等［17］證實，用他汀類藥物治療后氧化修飾低密度脂蛋白 (oxLDL)誘發(fā)IL-8和MCP-1分泌減少。本研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)患者臭氧自體血治療后IL-8減少，有助于解釋該治療具有抗感染鎮(zhèn)痛的作用。

痛風(fēng)患者的炎性因子紊亂在發(fā)病機制中起重要作用。臭氧自體血治療臭氧濃度為20～55 mg/L，通過活性氧物質(zhì) (ROS)和脂質(zhì)過氧化物 (LOPs)激活免疫系統(tǒng)可能造成大量抗感染性因子〔IL-10、IL-12、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF-β)〕釋放。Bocci等［18］和Sagai等［19］報道，體外實驗臭氧1 min內(nèi)能短暫性釋放IL-8，通過H2O2短暫的上升從細胞外進入細胞液中，激活核因子 (NF)-κB抑制IL-8，清除ROS不能產(chǎn)生IL-8。本研究結(jié)果也支持臭氧促進血清IL-8水平降低，IL-8水平升高可能加重患者痛風(fēng)疼痛的癥狀或者痛風(fēng)發(fā)作。與此相反，臭氧自體血治療期間患者均沒有痛風(fēng)急性發(fā)作，首先患者疼痛明顯減輕后IL-8水平下降。可能慢性痛風(fēng)患者的急性發(fā)作或持續(xù)疼痛的炎癥機制與IL-8有關(guān)，IL-8是痛風(fēng)的重要遞質(zhì)，也可能是痛風(fēng)患者急性痛風(fēng)發(fā)作和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測因素。

本研究從細胞水平探討了臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的可能機制，具有一定的創(chuàng)新性。存在的不足是患者對于治療后抽血檢查的依從性較差，導(dǎo)致研究患者例數(shù)較少;且本研究對象是痛風(fēng)患者，設(shè)立正常對照組不符合倫理要求。因此，本研究在獲得患者書面知情同意后，采用非隨機、非對照、非盲開放的試驗設(shè)計。

臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的細胞機制可能與抑制IL-8的釋放或作用有關(guān)，目前尚沒有臨床試驗評估IL-8治療痛風(fēng)的有效性;痛風(fēng)患者的IgM與MSU結(jié)合是否促進MSU晶體沉積尚未得出結(jié)果。解決以上問題需進行長期、前瞻性和對照研究，且臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的確切機制也有待進一步研究。

［1］ Hoffstein S，Weissmann G.Mechanisms of lysosomal enzyme release from leukocytes and interaction of monosodium urate crystals with dogfish and human leukocytes［J］.Arthritis Rheum，1975，18(2):153-165.

［2］ Quinn MT，Parthasarathy S，F(xiàn)ong LG，et al.Oxidatively modified low density lipoproteins:a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84(9):2995-2998.

［3］ Bocci V，Borrelli E，Travagli V，et al.The ozone paradox:ozone is a strong oxidant as well as a medical drug ［J］.Med Res Rev，2009，29(4):646-682.

［4］ Cao GQ，Li XH，Wu BS，et al.Safety and efficacy of ozonated autologous blood in treatment of patients with gout［J］.Chinese General Practice，2014，17(30):3609-3611.(in Chinese)

曹國慶，李秀華，武百山，等.臭氧化自體血治療痛風(fēng)患者疼痛的有效性和安全性研究 ［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2014，17(30):3609-3611.

［5］ Wallace KL，Riedel AA，Joseph-Ridge N，et al.Increasing prevalence of gout and hyperuri-cemia over 10 years among older adults in a managed care population ［J］.J Rheumatol，2004，31(8):1582-1587.

［6］ ChoiHK， Ford ES.Prevalenceofthemetabolicsyndromein individuals with hyperuricemia［J］.Am J Med，2007，120(5):442-447.

［7］ KramerHM， Curhan G.The association between goutand nephrolithiasis:the National Health and Nutrition Examination SurveyⅢ，1988-1994 ［J］.Am J Kidney Dis，2002，40(1):37-42.

［8］ Singh JA，Hodges JS，Toscano JP，et al.Quality of care for gout in the US needs improvement［J］.Arthritis Rheum，2007，57(5):822-829.

［9］ Fara N，Vazquez Mellado J，Sequeira G，et al.A survey on the current evaluation and treatment of gout in Buenos Aires，Argentina［J］.Reumatol Clin，2012，8(6):306-309.

［10］ Mikuls TR，Curtis JR，Allison JJ，et al.Medication errors with the use of allopurinol and colchicine:a retrospective study of a national，anonymous Internet-accessible error reporting system ［J］.J Rheumatol，2006，33(3):562-566.

［11］ Neogi T，Hunter DJ，Chaisson CE，et al.Frequency and predictors of inappropriate management of recurrent gout attacks in a longitudinal study ［J］.J Rheumatol，2006，33(1):104-109.

［12］ Kanevets U，Sharma K，Dresser K，et al.A role of IgM antibodies in monosodium urate crystal formation and associated adjuvanticity［J］.J Immunol，2009，182(4):1912-1918.

［13］ Gimbrone MA Jr， Obin MS， Brock AF， et al.Endothelial interleukin-8:a novel inhibitor of leukocyte-endothelial interactions［J］.Science，1989，246(4937):1601-1603.

［14］ DeForge LE，F(xiàn)antone JC，Kenney JS，et al.Oxygen radical scavengers selectively inhibit interleukin 8 production in human whole blood ［J］.J Clin Invest，1992，90(5):2123-2129.

［15］ DeForge LE，Preston AM，Takeuchi E，et al.Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress［J］.J Biol Chem，1993，268(34):25568-25576.

［16］ Nishimura A，Akahoshi T，Takahashi M，et al.Attenution of monosodium urate crystal-induced arthritis in rabbits by a neutralizing antibody against interleukin-8 ［J］.J Leuko Bio，1997，62(4):444-449.

［17］ Dje N'Guessan P，Riediger F，Vardarova K，et al.Statins control oxidized LDL-mediated histone modifications and gene expression in cultured human endothelial cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(3):380-386.

［18］ Bocci V，Valacchi G，Corradeschi F，et al.Studies on the biological effects of ozone:Effects on the total antioxidant status and on interleukin-8 production ［J］.Mediators Inflammation，1998，7(5):313-317.

［19］ Sagai M，Bocci V.Mechanisms of action involved in ozone therapy:is healing induced via a mild oxidative stress? ［J］.Med Gas Res，2011，20(1):29-31.