ALX-R和NF-κBp65在口腔扁平苔蘚病灶中的表達(dá)研究

宋典坤，關(guān)為群，王學(xué)瑩，劉瑜佳

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建福州350001）

ALX-R和NF-κBp65在口腔扁平苔蘚病灶中的表達(dá)研究

宋典坤，關(guān)為群，王學(xué)瑩，劉瑜佳

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建福州350001）

目的通過檢測脂氧素A4受體（ALX-R）及核因子-κBp65（NF-κBp65）在口腔扁平苔蘚（OLP）病灶黏膜中的表達(dá)情況，探討二者在OLP發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法采用免疫組化法檢測30例OLP組織（糜爛型OLP組16例，非糜爛型OLP組14例）與10例正?？谇火つそM織（對(duì)照組）中ALX-R和NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果（1）ALX-R蛋白，在糜爛型與非糜爛型OLP組織中表達(dá)陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；OLP組織中，糜爛型組NF-κBp65蛋白表達(dá)陽性率高于非糜爛型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）OLP組ALX-R蛋白表達(dá)陽性率低于對(duì)照組，NF-κBp65蛋白表達(dá)陽性率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；（3）OLP組和對(duì)照組中ALX-R與NF-κBp65的蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-1，P＜0.01）。結(jié)論ALX-R與NF-κBp65表達(dá)異?？赡芘cOLP的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

扁平苔癬，口腔； 受體，細(xì)胞表面； 脂氧素類； NF-κB； 免疫組織化學(xué)

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種在口腔黏膜病中僅次于復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的第二大常見疾病，發(fā)病率高，為0.11%～4.00%，常好發(fā)于中年女性[1]。OLP被世界衛(wèi)生組織列為癌前狀態(tài)，OLP患者癌癥發(fā)生率增高，主要見于久治不愈的萎縮糜爛型[2]。目前OLP病因不明，多數(shù)研究支持其與自身免疫異常相關(guān)。脂氧素（lipoxins，LXs）具有促使炎癥消退和調(diào)節(jié)免疫的作用，其抗炎作用50%通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)途徑，LXs的家族成員中最具有代表性的是LXA4，其主要通過與其受體ALX-R結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究通過檢測OLP患者口腔黏膜組織中ALX-R與NF-κBp65蛋白的表達(dá)，探討二者在OLP發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑耗材 兔抗人ALX-R多克隆抗體（北京博奧森），小鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒pv-9002、兔超敏二步法免疫組化試劑盒pv-9001、二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminpbenzidine，DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），倒置相差顯微鏡（Nikon TS-100，Japan）等。

1.1.2 病例選擇 本研究獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲取的標(biāo)本得到患者知情同意。選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2012～2013年口腔門診就診的OLP患者（診斷參照人民衛(wèi)生出版社版《口腔黏膜病學(xué)》第3版），經(jīng)活檢確診30例，根據(jù)臨床特征將30例OLP病損黏膜分為糜爛型組（16例）和非糜爛型組（14例）。另取10例正常口腔黏膜作為對(duì)照組。所選病例均符合以下排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有免疫系統(tǒng)性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、天皰瘡等；（2）患有腫瘤或其他部位的癌前病變；（3）需長期服藥以控制病情的慢性疾病，如冠心病、高血壓、糖尿病等；（4）患有血液系統(tǒng)疾病，如白血病、貧血等；（5）3個(gè)月內(nèi)使用過激素、免疫制劑者；（6）伴有其他口腔黏膜疾病或重度牙周病患者；（7）某些銀汞合金充填物或藥物可能引起苔蘚樣反應(yīng)者；（8）妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 口腔黏膜組織ALX-R及NF-κBp65蛋白的檢測 采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。ALX-R和NF-κBp65工作濃度均為1∶50，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素輕度復(fù)染，系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率綜合分析法。著色強(qiáng)度計(jì)分：按陽性細(xì)胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強(qiáng)（棕褐）分別計(jì)0、1、2、3分；每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野觀察，按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例計(jì)分：0～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別計(jì)0、1、2、3、4分。0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中等陽性（++）；6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)值比較采用方差分析，非參數(shù)檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系采用Pearson及Spearman相關(guān)檢驗(yàn)；組間差異的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色 OLP表現(xiàn)為上皮不全角化，粒層明顯，上皮釘突呈現(xiàn)不規(guī)則延長，下端有時(shí)變尖呈鋸齒狀?；准?xì)胞排列紊亂，基底膜界限模糊不清，基底細(xì)胞液化變性明顯者可形成上皮下皰。棘層、基底層或固有層內(nèi)可見嗜酸性紅染的膠樣小體及固有層有密集淋巴細(xì)胞浸潤帶，見圖1。

圖1 正?？谇火つそM織和OLP組織染色（HE，100×）

2.2 ALX-R和NF-κBp65免疫組化染色

2.2.1 ALX-R免疫組化結(jié)果 ALX-R蛋白表達(dá)于黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞和炎性浸潤細(xì)胞，定位于胞漿和胞膜，其在OLP組表達(dá)陽性率為43.3%（13/30），在對(duì)照組為90.0%，OLP組ALX-R蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但非糜爛型組和糜爛型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖2。

表1 ALX-R免疫組化結(jié)果

2.2.2 NF-κBp65免疫組化結(jié)果 在OLP組織中NF-κBp65的陽性染色定位于角質(zhì)形成細(xì)胞及炎性浸潤細(xì)胞的胞漿和胞核，其中以黏膜上皮棘細(xì)胞和基底細(xì)胞的胞核中表達(dá)較強(qiáng)，呈棕黃色顆粒，總表達(dá)陽性率為83.3%（25/30），10例正?？谇火つそM織表達(dá)陽性率為20.0%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其在非糜爛型組表達(dá)陽性率為64.3%，糜爛型組為100.0%，兩組表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 NF-кBp65免疫組化結(jié)果

圖2 NF-кBp65、ALX-R蛋白在各組織中的表達(dá)（SP法，200×）

2.3 ALX-R、NF-κBp65蛋白表達(dá)的相關(guān)分析 經(jīng)秩和檢驗(yàn)，OLP組織中ALX-R與NF-кBp65蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-1，P＜0.01），見表3；對(duì)照組中ALX-R與NF-кBp65蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-1，P＜0.01），見表4。

表3 OLP組織中ALX-R、NF-кBp65免疫組化相關(guān)性分析結(jié)果（n）

表4 對(duì)照組中ALX-R、NF-кBp65免疫組化相關(guān)性分析結(jié)果（n）

3 討 論

OLP主要是由細(xì)胞免疫功能異常導(dǎo)致的一種非特異性炎癥疾病[3]。ALX-R屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員，其主要與LXA4結(jié)合在免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。微觀上，轉(zhuǎn)錄及翻譯水平調(diào)節(jié)ALX-R的表達(dá)，宏觀上，促炎與抗炎介質(zhì)能調(diào)節(jié)ALX-R的表達(dá)，同時(shí)用藥及疾病狀態(tài)對(duì)其也有一定的影響[4]。ALX-R可表達(dá)于T淋巴細(xì)胞[5]、涎腺上皮細(xì)胞[6]、腸上皮細(xì)胞[7]、支氣管上皮細(xì)胞[8]、子宮內(nèi)膜細(xì)胞[9]及關(guān)節(jié)滑膜組織等[10]。Gewirtz等[11]運(yùn)用cDNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LXA4能與ALX-R結(jié)合后抑制NF-κBp65信號(hào)通路，從而抑制促炎基因的表達(dá)，炎癥因子表達(dá)量減少，炎癥免疫反應(yīng)減輕。ALX-R在口腔黏膜上皮是否表達(dá)未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，ALX-R蛋白在OLP口腔病損黏膜上皮組織中表達(dá)較正常黏膜下降，推測ALX-R表達(dá)的下調(diào)可能減弱了細(xì)胞對(duì)保護(hù)因子LXA4的反應(yīng)，從而LXA4對(duì)NF-κBp65信號(hào)通路依賴的促炎基因的抑制作用減弱，這可能是導(dǎo)致OLP發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。

近年來，許多研究把NF-кBp65作為藥物治療的靶點(diǎn)，有研究表明NF-кBp65導(dǎo)致了OLP炎性反應(yīng)遷延不愈，受NF-кBp65調(diào)控的炎癥因子，如TNF-α、IL-6等又會(huì)影響NF-кBp65的活性加速細(xì)胞的壞死，造成NF-кBp65的進(jìn)一步激活，以上正反饋調(diào)控可加重OLP及其他炎癥疾病局部的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥的惡性循環(huán)，造成局部炎性反應(yīng)慢性遷延[12-13]，因此通過抑制 NF-кBp65來治療OLP已得到廣泛關(guān)注[14]。本研究結(jié)果顯示，NF-кBp65在OLP中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示NF-кBp65的異常高表達(dá)可能參與了OLP的發(fā)病過程。另外，對(duì)NF-кBp65在OLP不同臨床分型的表達(dá)差異分析表明，NF-кBp65在糜爛型的表達(dá)顯著高于非糜爛型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其機(jī)制可能是活化的NF-кBp65介導(dǎo)大量炎癥因子，如IL-6、TNF-α等的表達(dá)，而炎癥因子又反饋性活化NF-кBp65，形成一個(gè)慢性遷延的過程，因而萎縮-糜爛型OLP會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的持續(xù)上皮損害。

NF-кBp65信號(hào)通路與機(jī)體多種免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，NF-кBp65能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育、成熟及凋亡等過程[15]。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)在OLP病損黏膜中NF-кBp65及其調(diào)控的下游炎癥因子的表達(dá)水平增高。綜上可推測，在OLP發(fā)病機(jī)制中，可能通過NF-кBp65的激活參與過度炎癥免疫反應(yīng)的過程。由于NF-кBp65是許多炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此抑制其活性有望控制炎癥疾病的發(fā)展及惡化。而國內(nèi)外許多研究已證實(shí)，LXA4能抑制LPS誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中NF-кBp65和AP-1的核轉(zhuǎn)位，并可下調(diào)IL-8表達(dá)。本研究通過探討ALX-R和NF-κBp65蛋白在OLP病灶中的表達(dá)特征及相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明ALX-R和NF-κBp65可能參與了OLP的發(fā)生、發(fā)展。王素梅等[17]發(fā)現(xiàn)子癇前期婦女胎盤癥狀越嚴(yán)重患者胎盤ALX-R表達(dá)越低而NF-κBp65越高，這與本研究結(jié)果是相似的。本研究結(jié)果表明，ALX-R、NF-κBp65可能參與了OLP的發(fā)生、發(fā)展，為進(jìn)一步研究OLP的發(fā)病機(jī)制和將LXA4應(yīng)用于治療OLP提供了新的啟發(fā)。

Wu等[18]將LXs的穩(wěn)定類似物15（R/S）-甲基-LXA4應(yīng)用于治療小兒濕疹，發(fā)現(xiàn)其能顯著緩解癥狀，促進(jìn)病變好轉(zhuǎn)，提高了患者的生活質(zhì)量，并證明所有安全參數(shù)保持在正常范圍內(nèi)，無不良反應(yīng)的發(fā)生。這給LXA4應(yīng)用于OLP的治療提供了一個(gè)新的思路。

[1]Serhan CN，Hamberg M，Samuelsson B.Lipoxins：novel series of biologically active compounds formed from arachidonic acid in human leukocytes[J].Proc Natl Acad Sci，1984，81（17）：5335-5339.

[2]R?dstr?m PO，Jontell M，Mattsson U，et al.Cancer and oral lichen planus in a Swedish population[J].Oral Oncol，2004，40（2）：131-138.

[3]Thornhill MH.Immune mechanisms in oral lichen planus[J].Acta Odontol Scand，2001，59（3）：174-177.

[4]常瑞，劉婷.脂氧素A4受體在炎癥中的作用[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2013，22（4）：320-327.

[5]Ariel A，Chiang N，Arita M，et al.Aspirin-triggered lipoxin A4 and B4 analogs block extracellular signal-regulated kinase-dependent TNF-alpha secretion from human T cells[J].J Immunol，2003，170（12）：6266-6272.

[6]Odusanwo O，Chinthamani S，McCall A，et al.Resolvin D1 prevents TNF-αmediated disruption of salivary epithelial formation[J].Am J Physiol Cell Physiol，2012，302（9）：C1331-1345.

[7]Gronert K，Gewirtz A，Madara JL，et al.Identification of a human enterocyte lipoxin A4 receptor that is regulated by interleukin（IL）-13 and interferon gamma and inhibits tumor necrosis factor alpha-induced IL-8 release[J].J Exp Med，1998，187（8）：1285-1294.

[8]Bonnans C，F(xiàn)ukunaga K，Levy MA，et al.Lipoxin A（4）regulates bronchial epithelial cell responses to acid injury[J].Am J Pathol，2006，168（4）：1064-1072.

[9]Macdonald LJ，Boddy SC，Denison FC，et al.A role for lipoxin A4as an anti-inflammatory mediator in the human endometrium[J].Reproduction，2011，142（2）：345-352.

[10]Conte FP，Menezes-de-Lima O Jr，Verri WA Jr，et al.Lipoxin A（4）attenuates zymosan-induced arthritis by modulating endothelin-1 and its effects[J].Br J Pharmacol，2010，161（4）：911-924.

[11]Gewirtz AT，Collier-Hyams LS，Young AN，et al.Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis[J].J Immunol，2002，168（10）：5260-5267.

[12]Santoro A，Majorana A，Bardellini E，et al.NF-kappaB expression in oraland cutaneous lichen planus[J].J Pathol，2003，201（3）：466-472.

[13]Barnes PJ，Karin M.Nuclear factor-kappaB：a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases[J].N Engl J Med，1997，336（15）：1066-1071.

[14]Rhodus NL，Cheng B，Bowles W，et al.Proinflammatory cytokine levels in saliva before and after treatment of（erosive）oral lichen planus with dexamethasone[J].Oral Dis，2006，12（2）：112-116.

[15]Siebenlist U，Brown K，Claudio E.Control of lymphocyte development by nuclear factor-kappaB[J].Nat Rev Immunol，2005，5（6）：435-445.

[16]Zhou G，Xia K，Du GF，et al.Activation of nuclear factor-kappa B correlates with tumor necrosis factor-alpha in oral lichen planus：a clinicopathologic study in atrophic-erosive and reticular form[J].J Oral Pathol Med，2009，38（7）：559-564．

[17]王素梅，唐卉，蘇莎，等.ALX-R在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及其與NF-κB p65的相關(guān)性[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2013，22（6）：477-480.

[18]Wu SH，Chen XQ，Liu B，et al.Efficacy and safety of 15（R/S）-methyllipoxin A（4）in topical treatment of infantile eczema[J].Br J Dermatol，2013，168（1）：172-178.

Study on expression of lipoxin A4 receptor and nuclear factor-κbp65 in lesions of oral lichen planus

Song Diankun，Guan Weiqun，Wang Xueying，Liu Yujia
（Affiliated Union Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001，China）

Lichen planus，oral； Receptors，cell surface； Lipoxins； NF-κB； Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.20.002

A

1009-5519（2015）20-3050-03

2015-07-09）

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013J01314）。

宋典坤（1988-），男，福建福州人，碩士研究生，主要從事口腔內(nèi)科臨床工作；E-mail：175685210@qq.com。

關(guān)為群（E-mail：gwqluck@126.com）。

【Abstatct】ObjectiveTo detect the expression of lipoxin A4 receptor（ALX-R）and the transcription nuclear factor κBp65（NF-κBp65）in oralmucosallesion of the patients with orallichen planus（OLP）and to investigate their possible roles in the pathogenesis of OLP．MethodsImmunohistochemistry was adopted to detect the expression of ALX-R and NF-κBp65 protein in the oral mucosa of 30 OLP patients（including 16 cases of erosive type and 14 cases of non-erosive type）and 10 cases of normal oral mucosa（control group）．Results （1）The positive rate of ALX-R protein expression had no statistical difference between the erosive type OLP tissue and the non-erosive type OLP tissue（P＞0.05）；in OLP oral mucosa tissue，the positive rate of NF-κBp65 protein expression in the erosive type group was higher than that in the non-erosive type group，the difference was statistically significant（P＜0.05）；（2）the positive rate of ALX-R protein expression in the OLP group was lower than that in the control group（P＜0.05），but the positive rate of NF-κBp65 protein expression in the OLP group was significantly higher than that in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；（3）the ALX-R protein expression in the OLP group and the control group was negatively correlated with the NF-κBp65 protein expression=-1，P＜0.01）.ConclusionThe abnormal expressions of ALX-R and NF-κBp65 in oral mucosa may be closely related with the pathogenesis of OLP．