脂肪來源干細(xì)胞移植抑制腦缺血大鼠Neurocan的表達(dá)

陳愛珍，胡方進(jìn)，林菲菲

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院血液內(nèi)科，福建龍巖364000）

脂肪來源干細(xì)胞移植抑制腦缺血大鼠Neurocan的表達(dá)

陳愛珍，胡方進(jìn)，林菲菲

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院血液內(nèi)科，福建龍巖364000）

目的 探討脂肪來源干細(xì)胞（ADSC）移植對腦缺血大鼠神經(jīng)蛋白聚糖（Neurocan）表達(dá)的影響。方法 選取清潔級成年雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組（大腦中動脈栓塞）和ADSC組（大腦中動脈栓塞后移植ADSC），每組18只。大腦中動脈栓塞模型采用改良Zea-Longa線栓制法，ADSC移植前用二脒基苯基吲哚標(biāo)記，ADSC組于造模成功1 d后經(jīng)側(cè)腦室注入ADSC（1×106cells）。分別于術(shù)后7、14、28 d將大鼠斷頭取腦，采用免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡檢測腦組織Neurocan蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 術(shù)后第7、14天模型組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)明顯升高，呈片狀不規(guī)則分布，至28 d下降，但仍高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后7、14 d ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)明顯減少，并持續(xù)至28 d，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ADSC移植后可減少腦缺血組織Neurocan表達(dá)，減少瘢痕產(chǎn)生，為后期神經(jīng)軸突的成熟及功能建立提供了有利環(huán)境，可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

干細(xì)胞； 疾病模型，動物； 顱內(nèi)栓塞和血栓形成； 蛋白聚糖類； 神經(jīng)軸突

以往認(rèn)為成年動物腦受損后神經(jīng)元不易再生，自我修復(fù)能力有限，因此，如何促進(jìn)腦損傷突觸再生是目前研究的焦點(diǎn)和難題。近年來，干細(xì)胞因具有多向分化潛能特性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療中取得一定進(jìn)展。前期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stemcell，ADSC）移植對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)具有一定促進(jìn)作用[1-3]，但具體機(jī)制仍不明確。目前認(rèn)為，神經(jīng)蛋白聚糖（Neurocan）是受損神經(jīng)元再生的主要抑制因子，參與了膠質(zhì)瘢痕的形成，抑制軸突生長。本研究主要通過研究ADSC移植對腦缺血組織Neurocan表達(dá)的影響，旨在為臨床治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取實(shí)驗(yàn)動物清潔級成年SD雄性大鼠（體質(zhì)量250～280 g）54只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。自來水喂養(yǎng)，自由進(jìn)食普通顆粒型大鼠飼料，動物房溫度控制在22～25℃。二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）由 Sigma公司提供；兔抗大鼠CD44、CD34、CD106抗體由Santa Cruz公司提供；細(xì)胞培養(yǎng)瓶由Coming公司提供；Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L胰酶、胎牛血清、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基/LG復(fù)合培養(yǎng)基由Gibco公司提供；小鼠抗大鼠單克隆Neurocan抗體（一抗）由Chemicon公司提供；山羊封閉血清、四甲基若丹明異硫氰酸鹽標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G-HRP（二抗）由北京中杉劍橋公司提供；小鼠抗大鼠β-actin抗體由武漢博士德公司提供；蛋白質(zhì)印跡（Western blot）試劑由碧云天公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 ADSC分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行ADSC分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記。

1.2.1.2 動物分組 將54只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組（大腦中動脈栓塞）和ADSC組（大腦中動脈栓塞后移植ADSC），每組18只。每組均按術(shù)后7、14、28 d不同時間點(diǎn)分為3個亞組，每個亞組6只。

1.2.1.3 腦缺血動物模型及ADSC側(cè)腦室移植模型的建立 參考改良Zea-Longa線栓法制備大腦中動脈栓塞模型，假手術(shù)組術(shù)中只暴露大腦中動脈，不插線栓。ADSC組于造模成功后24 h通過腦立體定位儀經(jīng)顱骨上鉆孔將側(cè)腦室套管在預(yù)定位置固定，用微量注射器注射DAPI標(biāo)記的ADSC（1×106cells）細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)[3]的方法操作。

1.2.1.4 腦組織標(biāo)本的采集 將大鼠腹腔麻醉（10%水合氯醛）后暴露心臟，經(jīng)左心室進(jìn)行主動脈插管作為灌注液入口，以剪開的右心耳為流出口，用生理鹽水200 mL快速沖洗，取出全腦，在冰盤上迅速分離出右側(cè)大腦半球視交叉后6～11 mm腦組織，部分保存于-80℃冰箱用于Western blot檢測；部分在恒冷切片機(jī)中速凍，制作冠狀切片（10 μm），固定晾干后放入-20℃冰箱保存用于免疫熒光檢測。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 免疫熒光檢測 腦組織標(biāo)本采用冰凍切片，室溫下復(fù)溫45～60 min，5 g/L Triton放置30 min，血清封閉1 h，滴加一抗（1∶200），4℃孵育過夜。第2天室溫放置1 h，滴加二抗（1∶200），避光1 h，每步驟均用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗，最后用甘油封片。重復(fù)上述方法，對照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗。放置熒光顯微鏡檢測。

1.2.2.2 Western blot檢測 取100 mg腦組織提取總蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBS清洗，封閉1 h（5%脫脂奶粉溶液），加一抗（1∶400），4℃孵育過夜，TBS清洗后加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。將膜進(jìn)行發(fā)光液處理，在暗室進(jìn)行膠片曝光顯影。采用ImageJ軟件以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSC的形態(tài)及鑒定 第3代培養(yǎng)的細(xì)胞多呈均一長梭形，并高表達(dá)ADSC表面特異性標(biāo)志物——CD44，而低表達(dá)CD106及CD34，見圖1。

圖1 ADSC的形態(tài)及鑒定

2.2 免疫熒光檢測結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織Neurocan少量表達(dá)，模型組大鼠腦組織Neurocan呈片狀不規(guī)則分布，見圖2。

2.3 Western blot檢測結(jié)果 術(shù)后7、14 d模型組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)增多，于28 d下降，但仍高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后各時間點(diǎn)ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)均明顯下降，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 術(shù)后14 d各組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)情況比較（免疫熒光，200×）

圖3 術(shù)后各時間點(diǎn)各組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)情況比較（Western blot）

3 討 論

有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后因神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、炎性細(xì)胞因子破壞、抑制因子分泌等各種不利因素環(huán)境下受損神經(jīng)元自我修復(fù)能力有限，即使神經(jīng)元軸突再生，大部分也難與突觸后神經(jīng)元建立新的功能性聯(lián)系，其中膠質(zhì)瘢痕是其主要障礙，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞在軸突延伸和遷移過程中遇到膠質(zhì)瘢痕屏障時就會被阻止繼續(xù)沿原方向運(yùn)動，無法正常發(fā)育和導(dǎo)向，失去行使神經(jīng)沖動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]。Neurocan是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的硫酸軟骨素蛋白聚糖，主要參與早期腦組織發(fā)育過程中軸突生長、形成和成熟，到成年時幾乎不表達(dá)，但在成年動物腦損傷中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。有研究在腦損傷區(qū)周圍皮質(zhì)中檢測到Neurocan在膠質(zhì)瘢痕表達(dá)明顯增多，同時與增生的神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性膠質(zhì)細(xì)胞相互重疊，提示Neurocan是伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS）增生產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子，可能是神經(jīng)修復(fù)的重要抑制分子，參與了膠質(zhì)屏障的形成，阻礙神經(jīng)軸突延長[5]。

近年來，干細(xì)胞因具有多向分化潛能特性，被用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究，目前，主要針對骨髓來源干細(xì)胞，已證實(shí)其在體外及腦缺血、脊髓損傷動物模型中均可減少抑制因子如Neurocan的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[6-7]。Mahmood等[8]研究也顯示，骨髓來源干細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷中通過抑制AS、Neurocan表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長。ADSC由于來源豐富，具有取材方便、移植免疫排斥反應(yīng)小、多向分化等顯著優(yōu)勢[9]也開始被國內(nèi)外很多研究嘗試用于治療腦缺血疾病，對ADSC在腦缺血大鼠神經(jīng)修復(fù)過程中可能的分子機(jī)制進(jìn)一步探索研究取得一定進(jìn)展。本研究觀察到術(shù)后第7、14天模型組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)明顯升高，呈片狀不規(guī)則分布，至28 d下降，但仍高于假手術(shù)組。腦梗死后神經(jīng)軸突生長主要經(jīng)歷3個關(guān)鍵階段：第7天是軸突出芽的起始觸發(fā)階段；第14天是軸突的持續(xù)生長階段；第28天是軸突再生的發(fā)育成熟階段[10]。根據(jù)本研究結(jié)果作者推斷，在亞急性期腦梗死周圍區(qū)Neurocan表達(dá)時間與軸突出芽基本一致，說明膠質(zhì)瘢痕對早期軸突出芽的觸發(fā)、再生、延伸及重建可能產(chǎn)生重要影響。雖然神經(jīng)元具有一定的自我修復(fù)力及可塑性，在后期可能逐漸建立側(cè)支循環(huán)恢復(fù)部分血供或分泌了一些有利因子，在一定程度上減少了Neurocan的表達(dá)，使未受損神經(jīng)元發(fā)生了一定軸突功能重建，但通過觀察大鼠恢復(fù)情況，這種自我修復(fù)能力很有限?？赡苡捎谠缙谳S突出芽起始觸發(fā)、維持階段明顯受限，至后期神經(jīng)再生軸突成熟相對明顯減少。因此，在此過程中提供有利因素促進(jìn)早期軸突出芽對神經(jīng)功能恢復(fù)相當(dāng)重要。術(shù)后7、14 d ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達(dá)明顯減少，并持續(xù)至28 d，提示ADSC對Neurocan表達(dá)具有抑制作用，為早期軸突觸發(fā)及再生創(chuàng)造了良好微環(huán)境，為后期神經(jīng)軸突的成熟及功能建立提供了有利環(huán)境，可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

總之，本研究進(jìn)一步證實(shí)了在腦缺血大鼠中生長抑制因子對神經(jīng)突觸重塑的重要影響，同時也表明，ADSC能有效抑制不利因子的表達(dá)，改善微環(huán)境，提高神經(jīng)修復(fù)能力，為臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

[1]王杰華，劉楠，杜厚偉，等.脂肪來源的干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血后微血管生成及bFGF和VEGF表達(dá)的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24（10）：958-961.

[2]杜厚偉，劉楠，王杰華，等.脂肪來源的干細(xì)胞移植對腦缺血大鼠腦組織IL-10及TNF-α表達(dá)的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25（11）：998-1001.

[3]陳愛珍，劉楠，黃歡，等.脂肪來源的干細(xì)胞移植對腦缺血大鼠神經(jīng)軸突再生的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（8）：868-871.

[4]Silver DJ，Silver J.Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment，injury，and cancer[J].Curr Opin Neurobiol，2014，27：171-178.

[5]Asher RA，Morgenstern DA，F(xiàn)idler PS，et al.Neurocan is upregulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes[J].J Neurosci，2000，20（7）：2427-2438.

[6]Mahmood A，Wu H，Qu C，et al.Effects of treating traumatic brain injury with collagen scaffolds and human bone marrow stromal cells on sprouting of corticospinal tract axons into the denervated side of the spinal cord[J].J Neurosurg，2013，118（2）：381-389.

[7]Shen LH，Li Y，Gao Q，et al.Down-regulation of neurocan expression in reactive astrocytes promotes axonal regeneration and facilitates the neurorestorative effects of bone marrow stromal cells in the ischemic rat brain[J]. Glia，2008，56（16）：1747-1754.

[8]Mahmood A，Wu H，Qu C，et al.Suppression of neurocan and enhancement of axonal density in rats after treatment of traumatic brain injury with scaffolds impregnated with bone marrow stromal cells[J].J Neurosurg，2014，120（5）：1147-1155.

[9]Desai VD，Hsia HC，Schwarzbauer JE.Reversible modulation of myofibroblast differentiation in adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. PLoS One，2014，9（1）：e86865.

[10]Hendel RC，Henry TD，Rocha-Singh K，et al.Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion：evidence for a dose-dependent effect[J].Circulation，2000，101（2）：118-121.

Adipose-derived stem cell transplantation for inhibiting Neurocan expression in rat with cerebral ischemia

Chen Aizhen，Hu Fangjin，Lin Feifei
（Department of Hematology，Affiliated Longyan First Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，Longyan，F(xiàn)ujian 364000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of adipose-derived stem cell（ADSC）on the Neurocan expression in rat with cerebral ischemia.Methods54 clean class adult male Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into the sham operation group，model group（middle cerebral arterial embolism）and ADSC group（ADSC transplantation after middle cerebral arterial embolism），18 cases in each group.The middle cerebral arterial embolism model adopted the modified Zea-Longa line embolism method.Before ADSC transplantation，diamidino-2-phenylindole（DAPI）labeling was performed.The ADSC group was injected with ADSC（1×106cells）by lateral ventricle on 1 d after successful model establishment.Rats were sacrificed for taking the brain on postoperative 7，14，28 d and the Neurocan protein expression was detected by using the immunofluorescence and Western blot.ResultsThe Neurocan expression of the brain tissues on postoperative 7，14 d in the model group was significantly increased and showed the sheet irregular distribution，which was decreased on 28 d，but still higher than that in the sham operation group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The Neurocan expression of the brain tissues on postoperative 7，14 d in the ADSC group was significantly decreased，moreover which continued to 28 d and showed the statistical difference compared withthe modelgroup（P<0.05）.ConclusionThe ADSCtransplantation can decrease the Neurocan expression in the brain ischemic tissues and reduce the scar generation，which provides the enabling environment for late nerve axons maturity and function establishment，and can promote the restoration of neural function.

Stemcells； Diseasemodels，animal； Intracranialembolismandthrombosis； Proteoglycans； Neuronalaxon

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.010

A

1009-5519（2015）24-3714-03

2015-09-24）

陳愛珍（1983-），女，福建漳平人，主要從事血液內(nèi)科臨床工作；E-mail：chenaizhen2003@163.com。