飲食限制聯(lián)合維生素D對(duì)Beclin1表達(dá)的誘導(dǎo)作用

武海燕,邱 齡,劉 蓉,吳晨棟

飲食限制聯(lián)合維生素D對(duì)Beclin1表達(dá)的誘導(dǎo)作用

武海燕,邱 齡,劉 蓉,吳晨棟

目的探討維生素D聯(lián)合飲食限制誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生以及對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)的影響。方法將18月老齡大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限食組,喂養(yǎng)6個(gè)月后,透視電鏡觀察大鼠肝臟細(xì)胞中的自噬體,免疫組化檢測(cè)大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)情況。結(jié)果電鏡下維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限制組均出現(xiàn)自噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。免疫組化顯示,與對(duì)照組相比,維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白表達(dá)的比值均明顯提高(P<0.01),且維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白的表達(dá)高于維生素D組、飲食限制組(P<0.01)。結(jié)論兩種不同的檢測(cè)細(xì)胞自噬方法證實(shí),維生素D以及維生素D聯(lián)合飲食限制均可增強(qiáng)細(xì)胞發(fā)生自體吞噬,且維生素D聯(lián)合飲食限制比單獨(dú)維生素D或者單獨(dú)飲食限制引起自噬的程度更高,提示維生素D與飲食限制可能通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

自噬;維生素D;飲食限制;Beclin1蛋白

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過(guò)程中都存在的一個(gè)凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定[1]。Beclin1參與自噬泡的形成過(guò)程,是新近被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物調(diào)控自噬性細(xì)胞死亡途徑的關(guān)鍵基因[2]。飲食限制(dietary restriction, DR)是指在提供生物體充分的營(yíng)養(yǎng)成分如必需氨基酸、維生素等,保證生物體不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的情況下,限制每日攝取的總熱量[1]。維生素D的激活形式1, 25-(OH)2D3作為一種多效型激素在人體許多不同的細(xì)胞中調(diào)控著將近900多種不同的基因表達(dá),并調(diào)控他們的增殖、分化與存活[37]。

本研究旨在飲食限制以及維生素D(VD)干預(yù)的情況下,觀察老齡大鼠中自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)和自噬小體的比例,研究飲食限制聯(lián)合維生素D對(duì)細(xì)胞自噬的影響,探索飲食限制與維生素D是否通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)進(jìn)40只18月的老齡大鼠,JEM-100CX II型透射電鏡(日本日立HITACHI公司H-600),超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司LKB-Ⅴ),活性VD(純度為99%)購(gòu)自Sigma公司,Beclin 1兔抗大鼠單克隆抗體、EnVision抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 動(dòng)物處理 40只18月老齡大鼠經(jīng)洗脫期后隨機(jī)分為4組,對(duì)照組、飲食限制組(DR組)、維生素D組(VD組)、維生素D聯(lián)合飲食限制組(DR聯(lián)合VD組),喂養(yǎng)6個(gè)月,每周測(cè)大鼠體重,灌胃VD 3μg/kg。

1.3 投射電鏡檢測(cè)自噬小體 經(jīng)過(guò)常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為50 nm),醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電鏡觀察、拍照、記錄。

1.4 免疫組化觀察腎皮質(zhì)細(xì)胞Beclin1蛋白的表達(dá)采用免疫組化法檢測(cè),組織蠟塊切片,烤片后脫蠟和水化,高壓抗原修復(fù),依次滴加過(guò)氧化物酶阻斷液(37℃封閉40 min)、體積分?jǐn)?shù)10%非免疫血清(37℃孵育40 min)、第一抗體(稀釋度均為1∶50,4℃過(guò)夜),生物素標(biāo)記的第二抗體(37℃孵育20 min)及鏈酶親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶工作液(37℃孵育20 min),DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹(shù)膠封片。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組細(xì)胞自噬泡比值和Beclin1的表達(dá)采用單因素方差分析,兩組之間的進(jìn)一步比較采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察 自噬體為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞漿成分或廢棄的細(xì)胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu)。透射電鏡下正常組肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴較多,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰,自噬體少見(jiàn)。限食組肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富,腫脹明顯,自噬體數(shù)量較多。維生素D組肝臟細(xì)胞線粒體豐富,線粒體體積增大,自噬體數(shù)量較多。維生素D組聯(lián)合飲食限制組線粒體明顯腫脹,出現(xiàn)大量自噬體。詳見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組自噬泡與胞漿面積的比值(±s)

表1 各組自噬泡與胞漿面積的比值(±s)

組別n自噬泡/胞漿面積對(duì)照組100.008 5±0.000 7 DR組100.013 3±0.001 11)VD組100.013 7±0.001 21)DR聯(lián)合VD組10 0.034 7±0.004 11)2)與對(duì)照組比較,1)P<0.01;與DR組、VD組比較,2)P< 0.01。

圖1 各組電鏡觀察結(jié)果

2.2 免疫組化顯示Beclin1蛋白表達(dá)增高 與對(duì)照組相比,DR組、VD組、DR聯(lián)合VD組腎皮質(zhì)細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),且DR聯(lián)合VD組Beclin1蛋白的表達(dá)高于DR組、VD組(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同組別Beclin1表達(dá)的比較(±s)

表2 不同組別Beclin1表達(dá)的比較(±s)

組別nBeclin1蛋白對(duì)照組100.165 0±0.007 9飲食限制組100.310 0±0.031 61)維生素D組100.340 0±0.200 51)維生素D聯(lián)合飲食限制組100.476 0±0.041 11)2)與對(duì)照組比較,1)P<0.01;與DR組、VD組比較,2)P< 0.01。

3 討 論

大量實(shí)驗(yàn)表明飲食限制可以引起細(xì)胞自噬,是除遺傳操作以外強(qiáng)有力的延緩衰老方法,被稱為衰老研究領(lǐng)域重大的發(fā)現(xiàn)[8]。近年來(lái)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性維生素D也能夠引起細(xì)胞自噬,成為自噬與衰老領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn),但目前的研究尚不清楚二者是否通過(guò)相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞自噬。

自噬主要的生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、RNA、過(guò)量?jī)?chǔ)存的糖原等)和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)在單位膜包裹的囊泡中大量降解,實(shí)現(xiàn)再循環(huán),以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定。這個(gè)過(guò)程對(duì)于細(xì)胞成分更新、保持旺盛的生理狀態(tài)是至關(guān)重要的[9]。自噬過(guò)程的信號(hào)調(diào)控目前有以下幾種:mTOR信號(hào)途徑、ClassⅠPI3K/PKB途徑、Gi3蛋白和氨基酸等。隨著年齡的增長(zhǎng),細(xì)胞自噬作用開(kāi)始減弱,細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境和自身防御反應(yīng)的能力降低,損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及大量氧自由基等不能有效地被清除,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化,加速細(xì)胞老化[10]。Beclin1是酵母菌atg/vps40基因在哺乳動(dòng)物中的同源物,參與自噬泡的形成過(guò)程,是新近發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物調(diào)控自噬性細(xì)胞死亡途徑的關(guān)鍵基因[8]。Beclin1基因在多種正常組織中均有表達(dá),因此可以通過(guò)檢測(cè)Beclin1蛋白的表達(dá)來(lái)間接反映自噬發(fā)生的強(qiáng)度。

電子顯微鏡是檢測(cè)細(xì)胞自噬的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。自噬體是內(nèi)源性物質(zhì)包括細(xì)胞內(nèi)由于生理或病理原因而被損傷的細(xì)胞器,或過(guò)量?jī)?chǔ)存的糖原等,被細(xì)胞自身的膜(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基復(fù)合體的膜)包裹形成。通過(guò)電鏡可對(duì)細(xì)胞的自噬體進(jìn)行定量。

活性維生素D與細(xì)胞的自噬有著相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示4組之間Beclin1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白的表達(dá)高于維生素D組和飲食限制組。這些結(jié)果顯示,維生素D、飲食限制二者聯(lián)合可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,且維生素D聯(lián)合飲食限制誘導(dǎo)細(xì)胞自噬比單獨(dú)的維生素D和單獨(dú)飲食限制作用更強(qiáng),支持維生素D與飲食限制二者聯(lián)合具有疊加作用,但維生素D與飲食限制究竟通過(guò)什么信號(hào)途徑需要進(jìn)一步探討。

參與自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子十分復(fù)雜。TOR激酶是氨基酸、三磷酸腺苷(ATP)和激素的感受器,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,是自噬的負(fù)調(diào)控分子,并發(fā)揮“門衛(wèi)(gatekeeper)”作用,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的核糖體蛋白質(zhì)S6(p70S6)抑制自噬的發(fā)生,它位于TOR信號(hào)途徑下游,其活性受mTOR調(diào)節(jié)[12]。外源性氨基酸的去除,可以阻斷TOR信號(hào)途徑,因此飲食限制可能通過(guò)阻斷mTOR途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶AMPKα(5’AMP-activated protein kinase)是細(xì)胞體內(nèi)的一個(gè)感受能量的激酶,能夠感受AMP的變化,誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,從而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解重新產(chǎn)生能量[13]。AMPK 通過(guò)抑制雷帕霉素-1(mTORC1)位點(diǎn)來(lái)引起細(xì)胞自噬。維生素的活性形式1,25-(OH) 2D3可促進(jìn)小腸對(duì)鈣磷的吸收,維持鈣磷正常代謝,調(diào)節(jié)腎臟對(duì)鈣磷的重吸收。維生素D經(jīng)血液維生素D結(jié)合蛋白(DBP)運(yùn)送至小腸細(xì)胞,與細(xì)胞膜表面受體Cubilin和Megalin結(jié)合后,進(jìn)入細(xì)胞核,與視黃醇類X受體(RXR),維生素D受體(VDR)復(fù)合物結(jié)合,并作用于目標(biāo)基因的維生素D反應(yīng)元件,產(chǎn)生鈣結(jié)合蛋白。維生素D可能通過(guò)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣調(diào)控蛋白[Ca2+]cyt,激活鈣離子依賴激酶CaMKK-β,進(jìn)一步激活磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶AMPK誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)證明飲食限制和維生素D聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞自噬具有疊加作用,但目前機(jī)制尚不明確,因此維生素D和飲食限制引起細(xì)胞自噬的具體信號(hào)通路需要進(jìn)一步的研究。

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R329.1

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.024

:1672-1349(2015)02-0200-03

2014-06-13)

(本文編輯郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(太原030001)

邱齡,E-mail:oldnestle@aliyun.com