不同發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)花生發(fā)根研究

任艷　江晨　王輝等

摘要：利用5種發(fā)根農(nóng)桿菌侵染不同花生外植體，對(duì)比其發(fā)根誘導(dǎo)率，分析尋找利于花生轉(zhuǎn)化的外植體、花生品種及發(fā)根農(nóng)桿菌。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌94022誘導(dǎo)發(fā)根率較其它發(fā)根農(nóng)桿菌高；后期繼代培養(yǎng)中子葉誘導(dǎo)的發(fā)根易于培養(yǎng)，存活率高，生長(zhǎng)狀態(tài)好；在用培養(yǎng)后的子葉為外植體時(shí)，花育20較其它品種發(fā)根誘導(dǎo)率高。

關(guān)鍵詞：發(fā)根農(nóng)桿菌；花生；外植體；發(fā)根誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S565.204.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0014-03

Abstract Five kinds of Agrobacterium rhizogenes were used to infect peanut explants and the root induction rates were contrasted to find the suitable explants， peanut varieties and A. rhizogenes for peanut transformation. The results showed that A. rhizogenes 94022 had higher root induction rate than the others. The hairy roots induced from cotyledon were easy to cultivate in the successive transfer culture with higher survival rate and good growth condition. With cultured cotyledon as explants， Huayu 20 had higher root induction rate than other peanut varieties.

Key words Agrobacterium rhizogenes； Peanut； Explants； Hairy root induction

發(fā)根農(nóng)桿菌能誘導(dǎo)大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物[1]，發(fā)根農(nóng)桿菌所含Ri質(zhì)粒的T-DNA通過(guò)整合進(jìn)入植物核基因組，并穩(wěn)定表達(dá)引起宿主植物發(fā)根[2]。發(fā)根起源于單個(gè)細(xì)胞，具有生長(zhǎng)迅速、遺傳穩(wěn)定、有利于高效表達(dá)克隆的篩選等特點(diǎn)[3]。用含改造型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞可將目的基因?qū)胫参锝M織再生出轉(zhuǎn)基因植株[4]。并根據(jù)插入位點(diǎn)的多樣性篩選出高效表達(dá)的發(fā)根無(wú)性系進(jìn)行生產(chǎn)和利用，是進(jìn)行次生代謝物質(zhì)離體調(diào)控和大規(guī)模生產(chǎn)的良好體系[5]。

花生是世界上廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，是我國(guó)第二大食用植物油和蛋白質(zhì)資源[6]。同時(shí)花生的根和莖等外植體中含有白藜蘆醇[7]，建立花生發(fā)根培養(yǎng)體系對(duì)尋求白藜蘆醇的新資源也有重要意義。本試驗(yàn)以5種發(fā)根農(nóng)桿菌和5個(gè)花生品種及其不同部位外植體為材料，分析尋找利于花生轉(zhuǎn)化的外植體、花生品種及發(fā)根農(nóng)桿菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試花生品種：魯花9號(hào)、豐花1號(hào)、花育20、魯花11、花育22。所用發(fā)根農(nóng)桿菌：S22、Ar-1、Ar-2、9402、94022。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

試劑有乙酰丁香酮、頭孢霉素、卡那霉素、利福平；培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)基。

1.3 無(wú)菌外植體的獲得

分別將5個(gè)花生品種的種子在70%乙醇中浸泡1 min，用無(wú)菌水沖洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用無(wú)菌水清洗4次，每次4～5 min。之后種于MS培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，6～8 d后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。

1.4 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的活化與培養(yǎng)

分別將發(fā)根農(nóng)桿菌Ar-1、Ar-2 和S22接種于添加50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將發(fā)根農(nóng)桿菌94022和9402接種于添加50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，27℃下活化3次。挑取平板上的單菌落，接種在同樣添加抗生素的50 mL 的YEB液體培養(yǎng)基上，27℃、170 r/min黑暗下振蕩培養(yǎng)16～18 h→在5個(gè)菌瓶中分別加入AS 1 000 μL→在27℃、170 r/min黑暗下振蕩培養(yǎng)1 h→在A600達(dá)到 0.5～0.8時(shí)侵染外植體。

1.5 外植體轉(zhuǎn)化及毛狀根誘導(dǎo)

取滅菌后花生子葉和生長(zhǎng)6～8 d的花生無(wú)菌苗子葉、幼葉、下胚軸、莖，各材料切成0.3～0.5 cm，并在外植體表面輕輕劃出幾道傷口，分別置于發(fā)根農(nóng)桿菌菌液（已培養(yǎng)的5種）中浸泡（幼葉：10～15 min；子葉、下胚軸、莖：15～20 min）后取出，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面多余菌液，接種于發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSo，于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。之后轉(zhuǎn)接到附加500 mg/L頭孢菌素的發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基5MSo上培養(yǎng)3～5 d，然后轉(zhuǎn)至附加300 mg/L頭孢菌素的發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基3MSo上培養(yǎng)12～15 d，再轉(zhuǎn)至無(wú)抗生素的發(fā)根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)根。侵染1個(gè)月后觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)根誘導(dǎo)率。

發(fā)根誘導(dǎo)率=產(chǎn)生發(fā)根的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌的發(fā)根誘導(dǎo)效果

由表1可看出，發(fā)根農(nóng)桿菌94022的平均發(fā)根誘導(dǎo)率最高為54.75%，其次是9402，為46.84%，Ar-1最低為32.81%。說(shuō)明發(fā)根農(nóng)桿菌94022最適宜誘導(dǎo)花生外植體發(fā)根。

2.2 不同花生外植體的發(fā)根誘導(dǎo)

由表1可看出，5種花生外植體均可誘導(dǎo)出發(fā)根，莖和下胚軸相對(duì)其它外植體其發(fā)根誘導(dǎo)率較高，其次是培養(yǎng)后的花生子葉，幼葉的發(fā)根誘導(dǎo)率最低。后續(xù)發(fā)根繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)花生子葉誘導(dǎo)的發(fā)根，生長(zhǎng)迅速，成活率高，容易擴(kuò)繁。綜合比較，選擇花生培養(yǎng)后的子葉為發(fā)根誘導(dǎo)外植體較為合適。endprint

2.3 不同花生品種的發(fā)根誘導(dǎo)

以花生培養(yǎng)后子葉為外植體誘導(dǎo)發(fā)根時(shí)，5種發(fā)根農(nóng)桿菌侵染不同花生品種的發(fā)根誘導(dǎo)率都以花育20為最高（表1），其中9402的誘導(dǎo)率為68.96%，94022的誘導(dǎo)率為83.20%，S22的誘導(dǎo)率為89.04%，Ar-1的誘導(dǎo)率為93.70%，Ar-2的誘導(dǎo)率為50.17%。

3 結(jié)論與討論

常用的發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)不同的植物毛狀根誘導(dǎo)能力存在差異。Fabricio等[8]采用3種發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、R1000、EHA105均誘導(dǎo)出毛狀根。Kim等[9]采用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株誘導(dǎo)發(fā)根。姚慶收等[10]采用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)，子葉沒(méi)有誘導(dǎo)出毛狀根，幼葉誘導(dǎo)率達(dá)65.6%，莖干誘導(dǎo)毛狀根生長(zhǎng)緩慢。劉杰等[11]采用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060和ATCC11325誘導(dǎo)發(fā)根，葉片最高誘導(dǎo)率為53.3%。任艷等[12]采用發(fā)根農(nóng)桿菌GIM1.141誘導(dǎo)發(fā)根，葉片誘導(dǎo)率為87.29%，子葉誘導(dǎo)率為75.8%。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同菌種和花生外植體，找到了相對(duì)適宜的組合來(lái)誘導(dǎo)發(fā)根進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。即用發(fā)根農(nóng)桿菌94022侵染花育20的培養(yǎng)后子葉進(jìn)行發(fā)根誘導(dǎo)，其發(fā)根誘導(dǎo)率相對(duì)較高，為83.20%，發(fā)根的后期繼代培養(yǎng)存活率高，容易擴(kuò)繁。

參 考 文 獻(xiàn)：

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