開拓創(chuàng)新、共謀發(fā)展，以基礎(chǔ)研究促臨床療效
——第六屆中國眼科學(xué)基礎(chǔ)研究大會暨研究生導(dǎo)師論壇側(cè)記

文圖/《中國醫(yī)藥科學(xué)》記者 費(fèi) 菲 曲莉莉

開拓創(chuàng)新、共謀發(fā)展，以基礎(chǔ)研究促臨床療效
——第六屆中國眼科學(xué)基礎(chǔ)研究大會暨研究生導(dǎo)師論壇側(cè)記

文圖/《中國醫(yī)藥科學(xué)》記者 費(fèi) 菲 曲莉莉

業(yè)界關(guān)注

“三月初的北京大學(xué)，已呈現(xiàn)出迎春花盛開、山桃花含苞待放的初春美景；未名湖畔、博雅塔旁，處處可見生機(jī)勃勃的景象。趁著此次論壇召開的東風(fēng)，我國眼科界迎來了科學(xué)研究的新的春天！”

本次論壇組織委員會主席、中華醫(yī)學(xué)會眼科學(xué)分會名譽(yù)主任委員黎曉新教授在開幕式上如是說。

她表示，每年一屆的眼科學(xué)基礎(chǔ)研究大會，是對一年來眼科科研工作的一次大檢閱，是大家交流經(jīng)驗(yàn)、切磋技藝的平臺。今年大會增添了諸多亮點(diǎn)，非常榮幸地請到三位院士以及美國、新加坡等國際友人為我們傳授經(jīng)驗(yàn)，使我們擴(kuò)展科研視野、激發(fā)科研靈感。“開拓創(chuàng)新、共謀發(fā)展”是我們這次會議的主題。我們力求把論壇辦得充實(shí)而實(shí)用——這次會議上，南加州大學(xué)Doheny眼科研究所的DavidHinton教授介紹胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的RPE單層在干性AMD的治療進(jìn)展；紐約哥倫比亞大學(xué)的StepenTsang教授講解偽裝成AMD的一組疾?。恍录悠禄蚪M研究院人類遺傳學(xué)首席研究員 KhorChieaChuen博士講授亞洲老年黃斑變性（AMD）的遺傳；香港中文大學(xué)的彭智培教授講近視的遺傳；南加州大學(xué)ShikunHe教授介紹干性AMD發(fā)病機(jī)制中Sirt的作用；國際眼科學(xué)院士PinarAydin教授現(xiàn)場講述SCI論文的書寫，并現(xiàn)場輔導(dǎo)5篇摘要和5篇全文，提高大家的論文寫作能力。本次論壇還安排了動物實(shí)驗(yàn)專題，有科研匯報(bào)和展板等各種形式的交流，必將起到提高科研素質(zhì)，共享經(jīng)驗(yàn)和開闊視野的效果。

黎曉新教授：眼底病中，血管生成因子與炎癥因子如何起作用？

據(jù)黎曉新教授介紹，在最近幾年的流行病調(diào)查中可以看出，老年黃斑變性（AMD）患者在50歲以上的人群中患病率較高，為27%，與白內(nèi)障26%的發(fā)病率基本相當(dāng)，逐漸上升為國內(nèi)老年人致盲的第一位原因。我們對AMD的認(rèn)識是基于各階段的病理性改變。AMD的臨床表型是不同的，早期AMD都以玻璃膜疣（drusen）的沉積為特征，位于內(nèi)膜上層的小膠質(zhì)細(xì)胞就游離進(jìn)入視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）層，Bruh膜隨之增厚，同時位于脈絡(luò)膜層的巨噬細(xì)胞也開始向RPE區(qū)聚集，逐漸走向脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的萎縮。

在AMD的早期和中期形成了玻璃膜疣的沉積、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞聚集，以及Bruch膜增厚的改變。這種改變導(dǎo)致了兩種病理反應(yīng)：一種是激發(fā)的炎癥反應(yīng)，一種是激發(fā)的低氧性的代謝性改變。如果發(fā)生了RPE的融合，逐漸產(chǎn)生了繼發(fā)視細(xì)胞變性，最后走向脈絡(luò)膜細(xì)胞的萎縮，這是AMD的干性改變。我們國人更常見的是濕性的改變，也包括前一段這些細(xì)胞的聚集，Bruch膜的增厚，它刺激了炎性因子和血管生成因子，所以導(dǎo)致了這種AMD濕性改變。

我們在“973”課題中，關(guān)于這部分研究有一些設(shè)計(jì)。正常情況下，視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的膜盤不斷脫落和再生，視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞不斷吞噬脫落的視細(xì)胞膜盤，這就呈現(xiàn)出一種正態(tài)的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)。如果某些因素使刺激增強(qiáng)，就會表現(xiàn)到補(bǔ)體通路、炎癥小體、細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)及血管生產(chǎn)因子。這些物質(zhì)的產(chǎn)生，使RPE走向不可逆的損傷，可能走向干性或是濕性。在干性方面是以炎癥因子為主，在濕性方面是以血管生成因子為主。簡言之，在老年黃斑變性的各個過程中，由于RPE吞噬功能的下降，導(dǎo)致了玻璃膜疣的沉積。巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞聚集以及Bruch膜增厚的改變，導(dǎo)致了兩種病理反應(yīng)——炎癥反應(yīng)因子和血管生成因子，導(dǎo)致了不同的表型——這是我們從病理學(xué)上看到的現(xiàn)象，那么，為什么有的人患病，有的人不患??？這就是基因的易感性造成的。

本課題組研究關(guān)于AMD各階段的可能分子發(fā)病機(jī)制的主要內(nèi)容：RPE復(fù)合體的損傷與保護(hù)機(jī)制，眼底新生血管AMD發(fā)病機(jī)制及干預(yù)策略。由于遺傳與環(huán)境導(dǎo)致的RPE功能障礙而出現(xiàn)炎性反應(yīng)和血管增殖反應(yīng)。

對于AMD三大易感基因之一的補(bǔ)體因子（CFH），我們課題組也已發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，在我國人群中，CFH與AMD相關(guān)，與國外樣本保持了一致。為什么CFH會導(dǎo)致AMD的改變？我們發(fā)現(xiàn)還是與抗氧化相關(guān)的。在基因功能研究中發(fā)現(xiàn)，CFH的保護(hù)性基因型H402Y可顯著增加CFH對氧化性脂類的結(jié)合能力，會導(dǎo)致一些病變的產(chǎn)生。H402Y抑制oxPLs與RPE細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的結(jié)合力。這個研究為我們對整個疾病的基因控制中，其表型到底是與氧化應(yīng)激關(guān)系更密切，還是與新生血管因子關(guān)系更密切，提供了進(jìn)一步的研究線索。氧化特異性抗原-氧化性磷脂（oxPLs）可促炎性及新生血管因子：CD36，IL-6和VEGF表達(dá)。我們在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)將遺傳-氧化應(yīng)激-免疫和新生血管進(jìn)行有機(jī)聯(lián)系。

AMD三大易感基因中，第二個主要基因是HTRA1。我們課題組把HTRA1轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎細(xì)胞里，生出來的小鼠可以看到其視網(wǎng)膜出現(xiàn)瘤樣血管擴(kuò)張。我們發(fā)現(xiàn)HTRA1與另外一種表型有一定的關(guān)聯(lián)。我們又進(jìn)一步做了細(xì)胞學(xué)形態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)是通過下調(diào)纖維連接蛋白的表達(dá)。纖維連接蛋白的降低也證實(shí)了與PCV易感基因有關(guān)，息肉樣脈絡(luò)膜血管病變（PCV）主要表現(xiàn)為一種毛細(xì)血管瘤樣擴(kuò)張，主要是擴(kuò)張?jiān)诿}絡(luò)膜毛細(xì)血管上。正如David Hinton教授講到的——AMD的病變實(shí)際是復(fù)合體，是累積到RPE繼發(fā)性地影響視細(xì)胞和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的病變。在濕性AMD中兩種類型的改變，PCE和我們通常見到的非PCE的區(qū)別點(diǎn)就在于毛細(xì)血管的形態(tài)學(xué)差異。我們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)：外顯子測序驗(yàn)證了以往發(fā)現(xiàn)，同時發(fā)現(xiàn)了CNV的新位點(diǎn)。通過基因功能研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1破壞血管壁，出現(xiàn)血管膨大病變。

AMD第三個主要的易感基因是ARMS2。它的作用至今不是十分明確。我們在細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，它與新生血管的生成能力是相關(guān)的。如果ARMS2發(fā)生了基因突變，它就會使炎性反應(yīng)增加，血管生成能力則下降，到底是什么細(xì)菌導(dǎo)致AMD，目前還不是十分清楚，這督促我們在這個領(lǐng)域里不斷地做工作。我們驗(yàn)證了以往發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)了nAMD新位點(diǎn)、PCV相關(guān)位點(diǎn)，及CNV與PCV差異位點(diǎn)（待驗(yàn)證）。通過基因功能研究發(fā)現(xiàn)，ARMS2突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和RPE細(xì)胞增殖、粘附及遷移等生物學(xué)行為；ARMS2突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)。在機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)了ARMS2與VEC血管生成之間建立聯(lián)系。

第四個基因是Toll樣受體（TLR3）基因，但目前機(jī)制不清，TLR3多態(tài)性保護(hù)AMD機(jī)制也不明確?；蚬δ苎芯堪l(fā)現(xiàn)：課題組證實(shí)dsRNA激活TLR3導(dǎo)致人干性AMD，TLR3 C1234T突變轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞可導(dǎo)致TLR3與dsRNA結(jié)合力降低一半，從而起到對干性AMD的保護(hù)作用。

我們通過對AMD患者人群的篩查，課題組發(fā)現(xiàn)了AMD新基因——HERPUD1，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了HERPUD1 rs2217332與我國人群PCV關(guān)系密切。盡管經(jīng)過大樣本調(diào)查還沒有完全證實(shí)它是PCV特有的，但在調(diào)查初期階段，對PCV和AMD本身是在一種基因組里再進(jìn)行細(xì)的分工，這在方法學(xué)上很不成熟。從功能學(xué)中把初篩中有一定的P值改變，但p值不是很高的一組基因，通過組織學(xué)去進(jìn)行驗(yàn)證。基因功能研究發(fā)現(xiàn)：HERPUD1高表達(dá)于 PCV膜，HERPUD1可上調(diào)Amyloid beta，后者導(dǎo)致血管生成因子的表達(dá)。

對于在血管生成因子的高表達(dá)的濕性AMD中，我們?nèi)绾翁剿鬟@一部分發(fā)病機(jī)制，要從血管新生的生成機(jī)制中去尋找它的相關(guān)因子。血管新生最開始是有一個新芽萌出的改變，以后長出一個莖細(xì)胞，然后又分化出一個尖端細(xì)胞。而這些不同階段都分別有各自的細(xì)胞因子去進(jìn)行配合和作用。我們開展的工作就是對整個新生血管發(fā)生的不同因子參與過程的行為——存活、移行、增殖和血管的通透性，都做了研究。

我們也對VEGF之外，與VEGF有很強(qiáng)協(xié)同作用的一些因子進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究，并且申請了專利。我們對國內(nèi)的康柏西普做了基礎(chǔ)研究，特別是PED——VEGF的拮抗因子也做了轉(zhuǎn)化研究。對于VEGF的不同亞型VEGF-A、VEGF-B等開展了很多研究，對它們的受體、炎癥反應(yīng)，以及血管生成之間的關(guān)系也做了研究和比較，發(fā)現(xiàn)了可能的研究線索。

隨著國際上對AMD不同階段發(fā)病的認(rèn)識，大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)產(chǎn)生了很多研究，美國學(xué)者主要研究該國AMD發(fā)病最主要的類型——干性AMD。他們的補(bǔ)體通路抑制劑——C5抑制劑研究已經(jīng)開始進(jìn)入臨床二期研究。由于抗VEGF的藥物治療都局限在抗體和受體上，目前的治療都短效，這樣給臨床的干預(yù)帶來了一定的問題。進(jìn)一步的研究是從其下游進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因治療，目前已經(jīng)進(jìn)入了一期研究；我們課題組也在開展一些相關(guān)研究。

誰來調(diào)控血管生成因子？我們最近在開展這項(xiàng)研究，還有很多工作需要完善，以便更好地控制這個過程，而不是被動地消除它已經(jīng)產(chǎn)生的不良影響。

AMD的發(fā)生是一個復(fù)雜的多因素疾病，但大家共同的認(rèn)識是，氧化應(yīng)激反應(yīng)后造成的RPE細(xì)胞的損害，以致RPE細(xì)胞功能的失常，是AMD發(fā)生的關(guān)鍵因素。在氧化應(yīng)激反應(yīng)的損害后，RPE細(xì)胞功能的失常促進(jìn)了中子的形成，繼發(fā)了局部的炎癥反應(yīng)，之后進(jìn)一步加速了RPE細(xì)胞功能的損害——這是惡性循環(huán)，最后導(dǎo)致了AMD的發(fā)生。

南加州大學(xué)何世坤教授：干性AMD發(fā)病機(jī)理：Sirt1作用明確

關(guān)于AMD發(fā)病機(jī)理的問題，目前討論非常多。我們從定義上可以發(fā)現(xiàn)，AMD的發(fā)生在人的生命的晚期，而不是早期。如果這個疾病完全是由遺傳基因造成的，從理論上說，大部分應(yīng)該在生命的早期就發(fā)病。我們已經(jīng)從遺傳學(xué)角度、基因敏感性等各方面開展了研究。那么，生活環(huán)境、整個細(xì)胞、微觀和宏觀的環(huán)境因素是否觸發(fā)了AMD的發(fā)生？近幾年，很熱門的表觀遺傳學(xué)特別注重環(huán)境因素是如何誘發(fā)疾病發(fā)生的。AMD的表觀遺傳學(xué)研究剛剛起步，發(fā)表的文章較少，氧化應(yīng)激反應(yīng)與AMD的發(fā)生、以及表觀遺傳因素的交互反應(yīng)在AMD發(fā)生中起了什么作用。我們擬從表觀遺傳學(xué)的角度來解釋AMD發(fā)病機(jī)理，引起大家的關(guān)注。

表觀遺傳學(xué)是研究基因及其表型的改變，而不涉及DNA結(jié)構(gòu)序列的改變，其研究實(shí)質(zhì)就是對DNA表面的化學(xué)的改變，有的表觀遺傳學(xué)已經(jīng)成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。一個人處在藍(lán)天白云、營養(yǎng)均衡的生活中，身體會處于正常的基本狀態(tài)。如果空氣和水質(zhì)被污染，生活壓力很大，這樣的生活會導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的改變，以致于造成基因異常的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤、糖尿病等一些疾病的發(fā)生。一些沒法解釋的疾病，也許可以從表觀遺傳學(xué)的研究角度獲得解答，找到治療的方法。表觀遺傳學(xué)對基因的調(diào)控作用主要體現(xiàn)在三方面：DNA的甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 調(diào)控，它們之間可以是單獨(dú)或相互作用的，基因在體內(nèi)的上調(diào)和下調(diào)就是取決于這些主要因素交互反應(yīng)后的結(jié)果。組蛋白修飾對基因的調(diào)控包括：乙?；腿ヒ阴；?，這兩種過程都是在酶的調(diào)控下進(jìn)行的。

正常情況下，組蛋白的乙酰化和去乙?；倪^程應(yīng)保持平衡，如果乙?；^度表達(dá)，會使基因轉(zhuǎn)錄受到了抑制。組蛋白對基因的修飾領(lǐng)域，目前的一個研究熱點(diǎn)是關(guān)于去乙?；秆芯?。組蛋白去乙?；福℉DAC）可分為4大類、18個成分。我們研究的是第三類Sirtuins家族中的功能較明確的沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1），它在AMD發(fā)病機(jī)理中究竟起到什么作用？現(xiàn)在還不清楚。

那么，Sirt1的功能究竟有哪些？它的功能很廣泛——人的壽命的長短與Sirt1的表達(dá)多少有關(guān)、它是氧化應(yīng)激反應(yīng)的保護(hù)體、它與細(xì)胞衰老有關(guān)（如紅酒可以促進(jìn) Sirt1的產(chǎn)生）等。

有的研究認(rèn)為，Sirt1在抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。氧化應(yīng)激（OS）是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，是導(dǎo)致人體疾病和衰老的重要因素之一。正常情況下，氧化應(yīng)激損害因子的產(chǎn)生和抑制因子應(yīng)處于平衡狀態(tài)，如果Sirt1的功能表達(dá)下降，以及其他抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的因子下降后，就會產(chǎn)生自由基，造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損害。Sirt1在眼睛里的表達(dá)，可以從角膜移植到后面的視網(wǎng)膜，有很多細(xì)胞都有Sirt1的表達(dá)。其表達(dá)的廣泛存在就說明它存在非常重要的作用，否則它不應(yīng)該有Sirt1的表達(dá)。

究竟Sirt1能否保護(hù)RPE免受陽光應(yīng)激反應(yīng)的損傷？我們做了體外實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)了視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞，用Sirt1 mRNA敲除Sirt1基因，用tBH作為氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑，隨著劑量的增加，我們可以看到，Sirt1 mRNA的表達(dá)明顯增高，超過了對照組。敲除Sirt1基因后，Sirt1的下游基因明顯受到了抑制。

由此我們得出結(jié)論：表達(dá)的減少可能與網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡及干性AMD的發(fā)病有關(guān)。Sirt1是一個重要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷的保護(hù)因子，上調(diào)Sirt1可能具有潛在預(yù)防干性AMD的作用。