HPLC 同時(shí)測定甘薯莖葉中葉黃素和β–胡蘿卜素

邢鵬，包兢兢，秦玉芝，陸英,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128)

類胡蘿卜素是一類具有多種生理功能的天然色素，可以預(yù)防人心血管疾病、癌癥及許多其他慢性疾病[1–2]，其中葉黃素、β–胡蘿卜素、玉米黃素、番茄紅素等10 余種已被廣泛用作抗氧化劑和食品、醫(yī)藥添加劑，在醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。

中國是世界上甘薯栽培第一大國，年產(chǎn)量約1.2億t，占世界總產(chǎn)量的85.9%[3]。甘薯莖葉作為甘薯產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，除部分食用或作牲畜飼料外，絕大部分被丟棄，造成了資源的極大浪費(fèi)。近年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)甘薯莖葉中含有多種生物活性成分，如黃酮類、綠原酸類等，同時(shí)還含有較高的葉黃素和β–胡蘿卜素，具有廣闊的開發(fā)利用前景[4–6]。不同植物品種含有的類胡蘿卜素種類、含量均有很大差異。采用HPLC 測定蔬菜果實(shí)中多種類胡蘿卜素組分時(shí)有的提取溶劑不同[7–8]，有的還進(jìn)行了皂化處理[9–10]，類胡蘿卜素總量或單個(gè)類胡蘿卜素都有降解損失，且甘薯或莖葉中葉黃素和β–胡蘿卜素的HPLC 測定多為單一組分，提取方法、流動(dòng)相組成等也不相同。本研究在對(duì)提取條件考察優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了HPLC 同時(shí)測定甘薯莖葉中葉黃素和β–胡蘿卜素的方法，操作簡便，方法可靠，并對(duì)11個(gè)品種甘薯莖葉進(jìn)行了葉黃素和β–胡蘿卜素含量測定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘薯品種為水果薯、水果花葉薯、紫羽1號(hào)、紫羽2號(hào)、農(nóng)大紫1號(hào)、農(nóng)大紫2號(hào)、浙紫1號(hào)、紫薯2號(hào)、高淀粉、葉用薯1號(hào)、葉用薯2號(hào)等，均采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院蔬菜基地。60℃下烘干、粉碎，備用。

葉黃素和β–胡蘿卜素對(duì)照品純度為90%，購于合肥博美生物科技有限公司。乙醇、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇均為分析純；甲醇、四氫呋喃、乙腈均為色譜純，購自恒興化學(xué)制造有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LC–10AT島津高效液相色譜儀，配有PDA檢測器，色譜柱WondasilTMC18(5 μm，4.6 mm×250 mm，日本島津公司)；SB3200DT超聲波清洗儀(寧波新芝科技股份有限公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相A 為甲醇–水(體積比為95∶5)； 流動(dòng)相B 為甲醇–乙腈–四氫呋喃(體積比為70∶20∶5)，梯度洗脫：0～10min，100% A；10～30min，100%～70% A，0%～30% B。檢測波長為445 nm。流速為1.0mL/min。柱溫20℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取葉黃素14.10mg、β–胡蘿卜素15.30mg于10mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1.269mg/mL 和1.377mg/mL 的儲(chǔ)備液，測定時(shí)逐級(jí)稀釋至0.253 8mg/mL、0.126 9mg/mL、0.0253 8mg/mL、0.0126 9mg/mL、0.634 5μg/mL、0.126 9μg/mL、0.063 45μg/mL，進(jìn)樣量10 μL,以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品溶液制備方法

1) 提取溶劑的確定。稱取紫羽1 號(hào)莖葉混合原料6 份，每份1.0g，分別加入40mL 甲醇、乙醇、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯，室溫下避光浸潤12 h，然后超聲提取20min，過濾，定容至50mL，過膜進(jìn)樣，測量不同提取溶劑中葉黃素和β–胡蘿卜素含量。重復(fù)2次，確定最佳提取溶劑。

2) 提取次數(shù)的確定。稱紫羽1 號(hào)莖葉樣品5份，按1)中確定的提取溶劑分別提取1、2、3、4、5次，根據(jù)提取效果確定提取次數(shù)。

3) 提取條件的優(yōu)化。采用1)中確定的提取溶劑，以料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為主要影響因素，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)(表1)，濾渣同法再提取1次，合并濾液，定容至100mL，進(jìn)樣，對(duì)提取效果進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，確定最優(yōu)提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平 Table 1 Orthogonal factors and levels table

1.3.4 方法學(xué)考察

1) 精密度試驗(yàn)。取葉黃素與β–胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算葉黃素和β–胡蘿卜素的RSD。

2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。稱取粉碎的紫羽1 號(hào)莖葉混合原料1.0g，加入30mL 甲醇，50℃超聲提取40min，過濾，濾渣同法再提取2次，合并濾液，定容至100mL，取20 μL 分別在0、1、2、4、6、8、24 h 進(jìn)行HPLC 分析，以峰面積計(jì)算葉黃素和β–胡蘿卜素的RSD。

3) 重現(xiàn)性試驗(yàn)：稱取紫羽1 號(hào)莖葉混合原料5份，每份1.0g，按穩(wěn)定性試驗(yàn)方法制備成甲醇提取液, 以峰面積計(jì)算葉黃素和β–胡蘿卜素的RSD。

4) 回收率試驗(yàn)：稱取紫羽1 號(hào)莖葉混合原料3份，每份1.0g，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品(葉黃素和β–胡蘿卜素分別為0.125 和0.137mg、0.252 和0.275mg、0.377 和0.413mg)，按穩(wěn)定性試驗(yàn)方法制成供試液，進(jìn)樣，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.5 樣品的測定

稱取粉碎的樣品1.0g，加入30mL 甲醇，50℃超聲提取40min，過濾，濾渣同法再提取2次，合并濾液，定容至100mL，取20 μL 進(jìn)行HPLC 分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中葉黃素、β–胡蘿卜素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯葉提取物的HPLC 分析

葉黃素和β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品及甘薯葉提取物的HPL 色譜圖見圖1。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，葉黃素的回歸方程為Y=9.7×106Χ– 1.9×105(R2=0.999 1)，線性范圍0.000 635～2.538μg；β–胡蘿卜素的回歸方程為Y=7.4× 106Χ– 50 189 (R2=0.999 3)，線性范圍0.006 885～ 2.538μg。

圖1 葉黃素和β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品及甘薯葉提取物的HPLC 色譜圖 Fig.1 HPLC chromatogram of lutein , beta-carotene standers and extracts of sweet potato leaves

2.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 最適提取溶劑

從表2 可知，甲醇、乙醇對(duì)葉黃素的提取效果較好，對(duì)β–胡蘿卜素的提取效果與其他常用提取溶劑的提取效果相近，但采用乙醇為提取溶劑，測定出的葉黃素峰形矮胖，柱效差，因此，選用甲醇作提取溶劑。

表2 不同溶劑提取的葉黃素和β–胡蘿卜素的含量 Table 2 Contents of different solvents on the efficiency of lutein and beta-carotene mg/g

2.2.2 最適提取次數(shù)

由表3 可見，葉黃素和β–胡蘿卜素的提取得率隨著提取次數(shù)的增加而增加，提取3次后2個(gè)目標(biāo)物的提取量已趨于穩(wěn)定，因此，確定試驗(yàn)提取次數(shù)為3次。

表3 各提取次數(shù)下的葉黃素和β–胡蘿卜素含量 Table 3 Contents of sequence on effect extract efficiency mg/g

2.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)的提取效果見表4。從表4 可知，最佳的提取方案為A1B3C1，即固液比1∶30，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間40min。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 4 Results of orthogonal experimen

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果，葉黃素和β–胡蘿卜素的峰面積RSD 為0.9%和1.8%，表明該方法具有較高精密度； 6 h 內(nèi)葉黃素與β–胡蘿卜素測定值基本穩(wěn)定，峰面積RSD 分別為1.2%和1.4%，表明該方法穩(wěn)定性好；重現(xiàn)性試驗(yàn)中，葉黃素與β–胡蘿卜素峰面積RSD 分別為1.3%和1.8%，表明該方法重復(fù)性好；葉黃素與β–胡蘿卜素的回收率分別為105.8%和101.5%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.4 甘薯莖葉中葉黃素及β–胡蘿卜素含量的測定

由表6 可見，11 份不同品種甘薯莖葉中的葉黃素及β–胡蘿卜素含量最高的是成熟葉，其次為新中葉，莖的含量最低，同一部位不同品種間的含量存在差異，成熟葉中的葉黃素含量0.504～1.031mg/g，β–胡蘿卜素含量0.188～0.467mg/g；新葉中葉黃素含量0.409～0.617mg/g，β–胡蘿卜素含量0.141～ 0.242mg/g；葉柄中葉黃素含量0.094～0.195mg/g，β–胡蘿卜素含量0.040～0.082mg/g；莖葉黃素含量0.053～0.103mg/g，β–胡蘿卜素含量0.036～0.045mg/g，其中花葉水果薯和紫羽1 號(hào)中的含量較高，其成熟葉中的葉黃素含量大于1mg/g，β–胡蘿卜素含量大于0.4mg/g。

表5 不同品種甘薯莖葉中的葉黃素和β–胡蘿卜素含量 Table 5 Lutein and beta-carotene content in sweet potato leaves and stems mg/g

3 討論

葉黃素與β–胡蘿卜素雖然都屬類胡蘿卜素，但葉黃素極性較大，可溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，而β–胡蘿卜素極性較小，不溶于水，易溶于氯仿、正已烷等溶劑，因此，測定時(shí)的提取溶劑及處理方法均有不同，需要針對(duì)不同的提取溶劑進(jìn)行比較。本研究采用了乙酸乙酯、乙醇、三氯甲烷、甲醇、正己烷、丙酮等作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑，對(duì)甘薯莖葉中的這2種組分提取效果均較好，經(jīng)3次提取后可基本提取完全。提取液直接注入HPLC 色譜儀，經(jīng)梯度洗脫，葉黃素和β–胡蘿卜素得到很好分離，方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，回收率高，確定該方法準(zhǔn)確可信。

近年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)甘薯莖葉中含有多種生物活性成分，如黃酮類、綠原酸類以及類胡蘿卜素等。本研究結(jié)果表明，非葉用品種與葉用品種的甘薯莖葉中葉黃素和β–胡蘿卜素含量差異不大，因此，不同品種的甘薯葉作為食用蔬菜均有較高的價(jià)值。

甘薯莖葉中葉黃素含量與普通萬壽菊葉黃素含量(16～20mg/g)[7]的差距很大，但由于甘薯莖葉產(chǎn)量大，價(jià)格低，來源廣，安全性高。因此，甘薯莖葉在提取方面仍具有一定優(yōu)勢，作為膳食補(bǔ)充劑開發(fā)，具有一定的發(fā)展前景。

在雞日糧中添加5%～8%的銀合歡粉(葉黃素含量為0.950mg/g)，蛋黃顏色會(huì)加深，添加8%～12%的苜蓿粉(胡蘿卜素含量為0.500mg/g)，蛋黃和皮膚的顏色也可以加深[11]，因此，甘薯葉作為飼料添加劑開發(fā)也具有較好的發(fā)展前景。

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