鼠曲草提取物及組分對α-淀粉酶的抑制作用

陸英，鄧林燕，朱麗娜，李覓路*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128)

鼠曲草(Gnaphlium affine D.Don)為菊科鼠曲草屬植物，又名佛耳草、清明菜等。鼠曲草提取物具有抗氧化及光防護[1]、抗炎抑菌[2]、抑制醛糖還原酶[3]、保肝[4]、昆蟲拒食[5]等作用。鼠曲草能抑制血小板凝集和黏連，預防中風、糖尿病及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[6]。

α–淀粉酶抑制劑是糖苷水解酶抑制劑中的一種，它能有效抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，降低食物中淀粉糖類物質的分解吸收，從而起到降低血糖、血脂的作用[7]。在農(nóng)業(yè)上，α–淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲消化道內(nèi)α–淀粉酶的活性，刺激昆蟲過量分泌消化酶，產(chǎn)生厭食反應，導致昆蟲發(fā)育不良或死亡。近年來，α–淀粉酶抑制劑在醫(yī)學及農(nóng)業(yè)上得到了廣泛應用。

筆者制備鼠曲草提取物，分離鑒定了鼠曲草提取物中的幾個多酚類化合物，并研究了鼠曲草提取物及幾個組分對α–淀粉酶的抑制作用及其中的一個組分抑制類型，旨在為鼠曲草資源的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試鼠曲草與試劑

鼠曲草于2012年4月中旬購于湖南吉首。

豬胰α–淀粉酶(SIGMA公司)；阿卡波糖(北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；可溶性淀粉(汕頭市西隴化工有限公司)；葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)；二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、正磷酸、3,5–二硝基水楊酸、氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉等均為國產(chǎn)，分析純。

1.2 儀器

LC–10AT 高效液相色譜(日本島津公司)，WondasilTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠)；UV–2600 型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；SK–1 快速混勻器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3 鼠曲草提取物的制備、分離和鑒定

鼠曲草提取物的制備：新鮮的鼠曲草于室內(nèi)自然陰干，置60℃烘箱中干燥后粉碎。取鼠曲草粉碎原料200g，用70%乙醇，料液比為1∶30，在80℃回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過濾減壓濃縮至無醇味，用鹽酸調節(jié)pH 至3.0，將提取液通過D101 樹脂(3 cm×60 cm，450mL)上樣，流速4 BV/h，吸附后靜置0.5 h，用1 BV 水洗去水溶性雜質，再用4 BV 的60%乙醇以3 BV/h 的流速洗脫，減壓濃縮后冷凍干燥，得鼠曲草提取物6.44g，于4℃冰箱中保存。

鼠曲草提取物的分離和鑒定：采用分析型高效液相色譜儀對提取物進行分離鑒定。色譜條件如下：流動相A 泵為0.5% 冰乙酸，B 泵為甲醇。梯度洗脫：0min(70%A 泵+30% B 泵)→15min(55%A泵+45% B 泵)→25min(55%A 泵+45% B 泵)→40min(30%A 泵+70% B 泵)，流速為1mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20 μL，檢測輸出波長328 nm。

1.4 鼠曲草提取物及組分對α–淀粉酶的抑制作用試驗

1.4.1 最適酶濃度和最適反應時間的選擇

取7支試管，分別加入質量濃度為0.02mg/mL的α–淀粉酶0.1mL，置于37℃水浴中預熱10min，加入37℃預熱的1%淀粉溶液0.1mL，酶反應開始后準確計時，每間隔1min加入0.2mL DNS終止反應，置沸水中水浴8min，迅速冷卻后用5mL蒸餾水稀釋，用分光光度計于540 nm處測定吸光值。改變酶濃度(0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL)，同法測定吸光值，作圖確定最適酶濃度和最適反應時間。

1.4.2 鼠曲草提取物及組分對α–淀粉酶的抑制作用試驗

取0.1mL質量濃度為0.06mg/mL豬胰α–淀粉酶溶液于試管中，分別加入0.1mL不同濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL)的樣品溶液(以阿卡波糖為陽性對照)，混合均勻并置于37℃水浴中預熱10min，加入0.1mL 37℃預熱的1%淀粉溶液，混勻，反應3min后立即加0.2mL DNS顯色劑，置沸水中水浴8min，迅速冷卻后用5mL蒸餾水稀釋，用分光光度計于540 nm處測定吸光值A1。以空白管為對照，不加抑制劑(以蒸餾水補足)，其他與抑制劑管操作相同，測定吸光值A0。背景管為對應濃度的抑制劑溶液，不加酶液(以蒸餾水補足)，其他與抑制劑管操作相同，測定吸光值A2，按下列公式計算抑制率。

1.5 2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖抑制類型的鑒別試驗

2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖的質量濃度為3mg/mL，底物為1%淀粉溶液，以緩沖溶液替代樣品溶液，在不同的酶濃度(0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL)下按1.4.2反應測定吸光值。當體系中不存在抑制劑時，酶活性測定的速率直線通過原點；當體系中存在不可逆抑制劑時，酶反應速率直線不通過原點，相當于將原點平行向右移動，若有一定量的可逆性抑制劑時，可得到一條通過原點、斜率低于無抑制劑組的直線。如果2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖是可逆性抑制類型化合物，則進一步進行可逆性抑制類型(競爭型和非競爭型)的鑒別試驗。試驗操作如下：固定酶質量濃度為0.06mg/mL，2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖質量濃度為3mg/mL，以淀粉溶液為底物，在不同濃度(0.5%、1%、1.5%和2%)的淀粉溶液下，按1.4.2 反應測定吸光值，通過雙倒數(shù)作圖法判斷是競爭型或非競爭型抑制類型。兩條直線的交點在縱軸為競爭型抑制劑，在橫軸上的為非競爭型抑制劑。

2 結果與分析

2.1 鼠曲草提取物的HPLC 分析

鼠曲草提取物的HPLC 色譜圖見圖1。由圖1可見，提取物中含有多個組分，其中含量相對較高的有7個組分，在330 nm 和220 nm 左右有較大吸收，具有明顯的酚酸類化合物的紫外吸收特征[9]，推測為多酚類化合物。本課題組從鼠曲草提取物中制備分離得到了7個組分，并鑒定出編號為3、5、7 的組分分別為3,5–O–咖啡?；鼘幩帷?,4–O–咖啡?；鼘幩帷?′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖。

圖1 鼠曲草提取物的HPLC 圖譜 Fig.1 HPLC chromatogram of the extract from Gnaphalium affine D. Don

2.2 鼠曲草提取物及組分對α–淀粉酶的抑制作用及抑制類型鑒別結果

2.2.1 最適酶濃度和最適反應時間的確定

不同質量濃度的α–淀粉酶在7min內(nèi)的反應動力學進程曲線見圖2。當酶質量濃度等于或低于0.08mg/mL時，在3min之內(nèi)反應均為線性反應。同時，為利于建立科學的反應動力學方程，使測定的反應速率(以ΔA/min表示)在(0.03～0.25)/min較好[9]，因此，選取最佳酶濃度0.06mg/mL，反應時間3min進行酶反應動力學的測定。

圖2 不同質量濃度α–淀粉酶的反應進程曲線 Fig.2 The reaction curve under different concentrations of α- amylase

2.2.2 鼠曲草提取物及3個組分對α–淀粉酶活性的影響

不同濃度的鼠曲草提取物及化合物對α–淀粉酶的抑制活性見表1。在試驗濃度范圍內(nèi)，樣品對α–淀粉酶活性均有一定抑制作用，隨著濃度的增加，抑制能力逐漸增強。當提取物、組分3、5、7及陽性對照阿卡波糖質量濃度為1.67mg/mL時，抑制率分別為32.37%、84.53%、63.07%、71.22%、94.12%。對樣品濃度與抑制率進行線性擬合，得到線性方程為：y提=17.265x + 3.237(R2= 0.998 4)；y3=45.429x + 9.247(R2= 0.997 6)；y5= 34.041x + 6.555(R2= 0.999 4)；y7=40.239x + 3.293(R2=0.993)；y阿=28.92x + 47.194 (R2=0.988 9)。根據(jù)方程計算出提取物及化合物3、5、7對α–淀粉酶的半抑制濃度IC50分別為2.71、0.90、1.28、1.16mg/mL，均高于阿卡波糖的半抑制濃度(0.10mg/mL)。

表1 樣品對α–淀粉酶的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of coumpounds from Gnaphalium affine D. Don on α-amylase

2.2.3 2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖對α–淀粉酶的抑制類型

不同濃度的α–淀粉酶在有或無2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖存在的條件下的反應速率見圖3。無抑制組的速率方程為y=0.488 5x(R2=0.986)，抑制組的速率曲線方程為y=0.269 5x (R2=0.987 8)，此直線通過原點，由此可知，化合物7對α–淀粉酶的抑制類型是可逆性抑制。由圖4可知，抑制組雙倒數(shù)曲線方程為y=288.91x+ 54.848(R2=0.978 4), 無抑制組雙倒數(shù)曲線方程為y=145.81x+27.94 (R2=0.997 4)，方程直線在橫軸上相交，為非競爭性抑制。

圖4 化合物7對胰α–淀粉酶的可逆抑制類型的雙倒數(shù)曲線 Fig.4 Lineweaver-burk plot for inhibition of compound 7 on α–amylase

3 結論

植物多酚由于具有良好的抗氧化和自由基清除活性而受到廣泛關注。近些年進一步研究[10–12]表明，一些植物的多酚如藍莓提取物、茶多酚等具有 較強的α–淀粉酶抑制活性。本試驗結果表明，鼠曲草提取物及其中的3個多酚類化合物對胰α–淀粉酶均具有較強的抑制作用，且呈明顯的量效關系，但不同化合物的抑制活性存在一定差異，3,5–O–咖啡酰基奎寧酸、3,4–O–咖啡?；鼘幩釣楫惥G原酸類化合物的同分異構物，但二者抑制α–淀粉酶的IC50分別為0.90、1.28mg/mL；2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖是一種查爾酮，它的IC50為1.16mg/mL，同時它為可逆的非競爭性抑制類型。

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