甜瓜CmERFIII-1轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA的克隆與表達(dá)分析

郭呈宇 孫曉蕾 邵琪 白立華 牛一丁 哈斯阿古拉

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021；2. 巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，巴彥淖爾 015000）

AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子大家族，因含有由60-70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域而得名，包含AP2、RAV、ERF、DREB和其他類別共5個(gè)亞家族［1]。1994年第一個(gè)AP2基因從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分離［2]，1995年從煙草中分離出乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Ethylene-inducible DNA binding proteins）ERF1、2、3、4，含有保守的ERF結(jié)構(gòu)域［3]。研究發(fā)現(xiàn)AP2/ERF家族中的成員參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及多種脅迫下的多種生物學(xué)過程，包括花發(fā)育［4]、果實(shí)發(fā)育［5]、種子發(fā)育［6]、病菌防御［7]、高鹽和干旱［8]等環(huán)境脅迫響應(yīng)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與乙烯、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且一些家族成員是逆境信號(hào)交叉途徑中的連接因子［9，10]。目前，擬南芥［11]、水稻［12]、甘藍(lán)型油菜［13]、番茄［14]、桃［15]等多種植物ERF家族基因的cDNA被克隆。Mizuno等［16]利用酵母單雜交技術(shù)從甜瓜中分離出與CM1-ACS2啟動(dòng)子上游GCCGAC序列相互作用的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子——CMe-DREBl、CMe-ERF1、CMe-ERF2。高峰等［17]從甜瓜中克隆獲得CMeERF1、CMeERF2的cDNA。Ma等［18]對(duì)甜瓜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因進(jìn)行了鑒定，得到136個(gè)成員，包括AP2亞家族13個(gè)、ERF亞家族119個(gè)、RAV亞家族4個(gè)；對(duì)ERF亞家族的119個(gè)成員進(jìn)行聚類分析，將其分為11個(gè)亞群。本研究選取其第三亞群的第一個(gè)成員CmERFIII-1，其在甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//melonomics.net）中的登錄號(hào)為MELO3C005465，克隆其cDNA，分析不同組織中的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植 物材料為甜瓜品種“河套蜜瓜”原種，由本實(shí)驗(yàn)室保存，種植于大田，采摘授粉后30 d的甜瓜果實(shí)，取中果皮組織于液氮中速凍，-80℃保存，用于基因克隆。采摘授粉后0、10、20、30和40 d的甜瓜果實(shí)，取中果皮組織速凍于液氮中，-80℃保存，用于不同發(fā)育階段果實(shí)中基因的表達(dá)分析。分別取培養(yǎng)于1/2 MS培養(yǎng)基35日齡河套蜜瓜無菌苗的根、莖和葉片組織，速凍于液氮中，-80℃保存，用于不同組織器官中基因的表達(dá)分析。

大腸桿菌E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。pEASY?-Blunt克隆載體購(gòu)自北京全式金公司?？俁NA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMMaster Mix Perfect Real Time及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix ExTaqII、高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymeras、dNTPs、氨芐青霉素、DNA Marker等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取 使用RNAiso Plus總RNA提取試劑盒，按照說明書提取甜瓜根、莖、葉和不同發(fā)育階段甜瓜果實(shí)的總RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已報(bào)道的CmERFIII-1基因cDNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物P1序列：5'-CATAACCAATCAACCAATTCC-3'，下游引物P2序列：5'-TTATATGACTGTGCATTGAGGAT-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 cDNA克隆 取采摘授粉后30 d甜瓜果實(shí)的總RNA 5 μg，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA第一鏈。

以合成的cDNA第一鏈為模板，用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymeras 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10 s，49℃退火15 s，68℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增片段用San-prep 型柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。純化產(chǎn)物與pEASY?-Blunt載體連接。連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，在Amp抗性培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆并經(jīng)PCR鑒定，隨機(jī)選取3個(gè)獨(dú)立的重組克隆由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。利用DNAStar軟件比對(duì)測(cè)序序列與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因cDNA序列（登錄號(hào)：MELO3C005465）。

1.2.4 編碼蛋白質(zhì)分析 利用NCBI的ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對(duì)CmERFIII-1序列進(jìn)行開放閱讀框分析。利用ExPaSy ProtParam（http：//web.expasy.org/ protparam/）、ExPASy ProtScale（http：// web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale.pl）、PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）、SWISS-MODEL（http：//swwissmodel.expasy.org/）對(duì)編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、親疏水性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)分析。利用NCBI的protein blast程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源比對(duì)分析，查找與預(yù)測(cè)的CmERFIII-1蛋白序列一致性較高的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA5.1軟件中的Neighbor-Joining算法進(jìn)行聚類分析。

1.2.5 基因表達(dá)分析 利用PrimeScriptTMMaster Mix Perfect Real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分別以河套蜜瓜根、莖、葉和授粉后0、10、20、30和40 d的甜瓜果實(shí)總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將合成的cDNA第一鏈用SYBR?Premix Ex Taq II實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)CmERFIII-1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，上下游引物分別為5'-TACTCTGTAGGATCGGCGGTT-3'和5'-GCGGTATCATAAGTTCCAAGCC-3'。以甜瓜GAPDH（登錄號(hào)：MELO3C002342T1）基因?yàn)閮?nèi)參基因，上下游引物分別為5'-CGTGTTCCTACCGTTGATGTCTCT-3'和5'-TCAGTGTACCCCAAAATTCCCTTC-3'。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板建立25 μL PCR擴(kuò)增體系：加入SYBR?Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，上游、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，混勻。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT［19]方法進(jìn)行分析，將葉片中CmERFIII-1基因表達(dá)量設(shè)定為1。標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）來自3個(gè)獨(dú)立生物學(xué)樣本，每個(gè)生物學(xué)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 cDNA的克隆及序列分析

2.1.1 RT-PCR產(chǎn)物分析 RT-PCR擴(kuò)增后得到約750 bp的特異性條帶（圖1），與預(yù)期相符。

圖1 甜瓜CmERFIII-1基因cDNA擴(kuò)增

2.1.2 cDNA序列及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 將克隆得到的cDNA序列與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中MELO3C005465序列比對(duì)，兩條序列一致性達(dá)100%。克隆到的CmERFIII-1cDNA序列為711個(gè)核苷酸，ORF Finder軟件分析結(jié)果（圖2）表明，該基因編碼由236個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的分子量為25.99 kD，理論等電點(diǎn)為8.39，對(duì)該蛋白質(zhì)的親疏水性分析表明其為親水性蛋白質(zhì)。

圖2 河套蜜瓜CmERFIII-1基因cDNA ORF及推測(cè)的氨基酸序列

2.1.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 對(duì)CmERFIII-1基因cDNA所編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)α螺旋占12.29%，無規(guī)則卷曲占80.51%，鏈接部分占7.21%。推測(cè)該蛋白質(zhì)序列中第52、77、79、92、107、163、165-167、178和182位氨基酸是該轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)（protein-binding domain）；第84-86、85-89、90-95和97位氨基酸是該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain）（圖2）。對(duì)蛋白質(zhì)GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有與DNA結(jié)合的分子功能可信度為65%，具有轉(zhuǎn)錄因子活性的可信度為49%，具有與蛋白質(zhì)結(jié)合的分子功能可信度為21%。亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.1.4 CmERFIII-1中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)CmERFIII-1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域（圖2中下劃線氨基酸序列）分析發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域與擬南芥中AtERF1［17]的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域一致性為80.33%。以擬南芥中AtERF1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域（圖3-B）作為模板，預(yù)測(cè)CmERFIII-1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)（圖3-A）。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 CmERFIII-1中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)空間結(jié)構(gòu)

通過對(duì)CmERFIII-1蛋白質(zhì)與不同物種中同源蛋白質(zhì)的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白氨基酸序列中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域與多種植物的ERF亞家族成員相似。篩選序列一致性在40%以上的12條序列，利用MEGA5.1分析并構(gòu)建聚類關(guān)系圖（圖4）。12條序列分別來自：甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、櫻桃番茄（Solanum lycopersicum）、蘋果（Malus domestica）、油菜（Brassica napus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、甘薯（Coffea canephora）、獼猴桃（Actinidia deliciosa）和柑橘（Citrus clementina）。克隆到的河套蜜瓜CmERFIII-1與GenBank中登錄號(hào)為XP_008436974.1的氨基酸序列一致性為100%，與黃瓜的2條氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)為XP_004143677.1和XP_004158119.1）序列一致性分別為92%和88%。

2.3 表達(dá)特性分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CmERFIII-1基因在甜瓜不同組織和果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖5）顯示，CmERFIII-1基因在根、莖、葉以及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期均有不同程度的表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量最高。

3 討論

ERF是一類植物特有的乙烯應(yīng)答因子家族，位于乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游，含有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與乙烯誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的GCC-box結(jié)合來調(diào)節(jié)一系列乙烯應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄［3]。擬南芥中AtERF1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域可以與下游基因啟動(dòng)子中GCC-box相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控［20]。本研究對(duì)河套蜜瓜CmERFIII-1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)推測(cè)發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)位于其AP2/ERF結(jié)構(gòu)域內(nèi)；進(jìn)一步對(duì)CmERFIII-1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域與擬南芥中AtERF1的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域一致性較高，為80.33%；由此推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子可能與AtERF1具有相似的功能，即與乙烯誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的GCC-box發(fā)生相互作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)。目前對(duì)ERF亞家族成員研究發(fā)現(xiàn)，不同的ERF成員在不同植物中表達(dá)部位不同。在蘋果（Malus domestica）中ERF亞家族成員MdERF1主要在成熟果實(shí)中表達(dá)，在其它組織中表達(dá)量很低［21]。而從李（Prunus salicina）中分離得到的PsERF2a和PsERF2b在果實(shí)發(fā)育過程中則沒有呈現(xiàn)遞增或遞減的表達(dá)規(guī)律，而是在花中高水平表達(dá)［15]。獼猴桃（Actinidia deliciosa）AdERF4、AdERF6隨果實(shí)的發(fā)育成熟表達(dá)量逐漸下降，而AdERF5在根、莖、葉、花和果實(shí)中的表達(dá)量均很低，但在花和成熟果實(shí)中的表達(dá)量高于其他組織［22]。甜瓜中CMeERF1和CMeERF2兩個(gè)基因的表達(dá)與內(nèi)源乙烯生成量顯著相關(guān)［17]。本研究通過對(duì)河套蜜瓜CmERFIII-1基因在根、莖、葉和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因在根、莖、葉及果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期均有不同程度表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高，推測(cè)該蛋白在葉片中發(fā)揮重要作用。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物整個(gè)生命周期中參與多種生理生化和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過程，因此對(duì)該類轉(zhuǎn)錄因子基因的分離及其表達(dá)和功能的研究有重要意義。

圖4 CmERFIII-1系統(tǒng)進(jìn)化聚類

圖5 CmERFIII-1基因表達(dá)分析

4 結(jié)論

從河套蜜瓜果實(shí)中克隆得到CmERFIII-1基因711 bp cDNA，編碼一個(gè)由236個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該cDNA序列與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中ERF基因（登錄號(hào)MELO3C005465）的核苷酸序列一致性達(dá)100%。由該cDNA所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與黃瓜ERF亞家族2個(gè)成員的氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)：XP_004143677.1和XP_004158119.1）一致性較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，該基因在河套蜜瓜葉片中表達(dá)量最高。

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