煙草綠原酸合成關鍵基因NtHQT1的克隆及表達分析

武明珠，許亞龍，李鋒，魏攀，王中，羅朝鵬，王燃，張劍鋒，林福呈，楊軍

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

煙草綠原酸合成關鍵基因NtHQT1的克隆及表達分析

武明珠，許亞龍，李鋒，魏攀，王中，羅朝鵬，王燃，張劍鋒，林福呈，楊軍*

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）是煙葉中含量最高的多酚類物質(zhì)，羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是植物綠原酸合成代謝途徑中的關鍵酶。為研究HQT基因在煙草綠原酸合成中的作用機制，通過同源克隆技術從煙草中克隆到一個新的HQT基因，命名為NtHQT1。生物信息學和激素處理后基因表達模式分析結果表明:NtHQT1 cDNA全長1 305 bp，編碼435個氨基酸，NtHQT1定位在細胞質(zhì)中，屬于疏水性蛋白，其二級結構主要是螺旋和無規(guī)則卷曲；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、生長素（3-Indoleacetic acid，IAA）、獨角金內(nèi)酯類似物（GR24）、細胞分裂素（6-Benzylaminopurin，6-BA）和赤霉素（Gibberellic acid，GA）能明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達，脫落酸（Abscisic acid，ABA）對基因表達沒有明顯作用，預示NtHQT1基因在煙草生長發(fā)育和抗病等生物學過程中發(fā)揮重要作用。

煙草；綠原酸；NtHQT1；克?。恍蛄蟹治?；表達分析

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA），又名咖啡單寧，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁等藥理學作用［1-3］。綠原酸可以被小腸直接吸收，或是經(jīng)過大腸的菌群水解后變成咖啡酸（Caffeic acid）［4-6］，咖啡酸和綠原酸均具有較強的抗氧化能力［7］。有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸清除自由基的能力明顯高于經(jīng)典的抗氧化劑抗壞血酸［8-9］。綠原酸在一些中藥材如金銀花、杜仲等中含量較高，也是煙葉中含量最高的多酚類化合物，約占總多酚含量的70%～90%［10］。

綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，其合成受多種因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)光照強度影響綠原酸在植物葉片中的積累，冬季生長在光照充足條件下的葉片中綠原酸含量較背陰條件下明顯增高；夏季葉片中的綠原酸含量則比冬季增高一倍［8］。另外還發(fā)現(xiàn)一些病原菌侵染能提高植物綠原酸含量，當煙草遭受根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）侵染時根和葉中的綠原酸含量明顯增高［11］。稻瘟病菌絲和培養(yǎng)濾液中的提取物處理水稻和水稻愈傷組織都能誘導綠原酸的生物合成［12］，這可能與綠原酸能提高植物的抗病性有關。此外有研究發(fā)現(xiàn)植物在缺硼條件下綠原酸的合成顯著增加［13］。羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是綠原酸合成代謝途徑的關鍵酶。敲除HQT基因能夠顯著降低煙草綠原酸含量，在番茄中HQT基因過表達，則綠原酸含量明顯上升［14］。目前對于煙草綠原酸的合成代謝途徑研究較少，為此，在普通煙草紅花大金元中克隆到了NtHQT1基因，對其進行了相關生物信息學分析，并研究了不同激素處理對基因表達的影響，旨在為揭示煙草綠原酸的合成代謝途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

普通煙草（Nicotiana tabacum）紅花大金元種植于國家煙草基因研究中心的人工氣候溫室，采集移栽后4周的煙草幼苗用于HQT1基因克隆。另選取移栽后4周的煙苗分別用10μmol/L脫落酸（Abscisicacid，ABA）、50μmol/L赤霉素（Gibberellic acid，GA）、100μmol/L茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、10μmol/L獨角金內(nèi)酯類似物（GR24）、5μmol/L 3-吲哚乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA）和10μmol/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurin，6-BA）激素溶液對煙苗進行噴霧處理；對照則采用等體積的雙蒸水（CK）。均勻噴灑煙草葉片，以葉片均勻附著一層小水珠為準。每處理設置3個獨立的重復，每重復為3株長勢一致的煙苗；每種激素處理后單獨放置，避免激素間產(chǎn)生交叉作用，在激素處理8 h后采樣用于基因表達模式分析。

1.2 煙草總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德來生物科技有限公司）提取不同處理煙草總RNA，具體方法參照試劑盒說明書。利用DNA酶（DNase I）去除RNA中殘留的少量DNA。提取出的煙草不同處理的RNA，采用NanoDrop2000超微量分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）測定OD230、OD260和OD280值并計算濃度，同時用2100生物分析儀（美國安捷倫公司）測定RNA的完整性。選擇純度高、完整性好的總RNA用于cDNA第Ⅰ鏈的合成，具體步驟參照PrimeScript?Reverse Transcriptase（［寶生物工程（大連）有限公司］）試劑盒說明書。

1.3 基因全長克隆

以煙草及茄科植物馬鈴薯和番茄的HQT全長cDNA序列為探針，在NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，對查找到的普通煙草EST序列進行拼接比對。然后再用拼接的基因序列在GeneBank中進行比對，根據(jù)與其他同源物種的相似度和一致性確定片段的正確性和編碼序列的完整性。并根據(jù)拼接序列設計全長引物，上游引物：5′-ATGAGGATCAATATTAAGGAAT-3′，下游引物：5′-AAATTCATACAAGTACTTCTCA-3′，并由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應體系25μL，包括ddH2O 9.7 μL、PremixTaq 12.5 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL和cDNA 2 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60～90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］回收目的片段；用純化回收的目的片段連接pMD19-T載體，4℃過夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取白色單菌落，37℃控溫搖床搖菌12 h左右（200 r/min）；以微量菌液為模板進行PCR驗證是否為陽性克隆。含有目的片段的重組質(zhì)粒由北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

對獲得的HQT1基因序列用ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析NtbHLH93蛋白中各種氨基酸含量（質(zhì)量分數(shù)），并預測理論分子量和等電點；TMHMM Server（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析其跨膜結構域；SingnalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白信號肽；PredictNLS（http：//www.psort.org/）分析蛋白細胞核定位信息；通過MEME（Multiple Expectation for Motif Elicitation）在線軟件（http：// meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）尋找潛在的基序（Motif）；采用ProtParam在線分析軟件分析煙草NtHQT1蛋白序列；用SMART在線分析軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtbHLH93蛋白的保守結構域；使用NCBI Blast在線工具進行核酸及氨基酸序列的同源性比對，并搜索下載相關序列；用Clustal W軟件對煙草、擬南芥、水稻、番茄、土豆等植物的bHLH93序列進行比對，采用MEGA 5.2軟件，通過鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)進化樹；用PSIPRED軟件（http：//bioinf.cs. ucl.ac.uk/psipred/）預測NtbHLH93蛋白質(zhì)的二級結構；用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel. expasy.org/）分析NtbHLH93蛋白的三級結構。

1.5 熒光定量PCR分析

根據(jù)克隆到的基因序列設計qRT-PCR引物：上游引物：5′-TGACAAATTCAGCCAAGA-3′，下游引物：5′-CGATAAATCGGGCAGTAA-3′；采用煙草的L25基因作為內(nèi)參基因［15］，上游引物：5′-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3′。定量PCR分析儀器為LightCycler?96（Roche，http：//www. roche.com/index.htm），所用試劑均為SYBR Premix Ex TaqTM［寶生物工程（大連）有限公司，http：//www.takara-bio.com/］，qRT-PCR反應體系：按照說明書的要求在冰上配制20μL反應體系，包括SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各0.2 μmol/L，每個反應含約50 ng的cDNA，以不加模板作為陰性對照。PCR反應程序：94℃預變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)［16］。反應結束后，根據(jù)得到的CT值，用2－△△CT方法計算相對表達量［17］。經(jīng)L25基因標準化后，以相同處理時間對照的相對表達量為1，基因的相對表達量為該基因與同一時間對照處理組的比值。所有數(shù)據(jù)是3次獨立實驗結果的平均值，用Duncan’s法進行差異顯著性分析（P＜0.05和P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 HQT1基因克隆

以移栽后4周煙草幼苗的cDNA為模板，通過設計的特異引物進行PCR擴增，得到1條長度約為1 300 bp（圖1）的條帶。用PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，以微量菌液為模板進行PCR驗證，含有陽性克隆的菌液由北京華大基因研究中心進行測序，經(jīng)測序驗證無誤。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

2.2 生物信息學分析

對獲得的基因序列使用NCBI Blast在線工具進行核酸相似性比對。結果顯示：該基因與其他植物HQT序列高度相似。與茄科植物馬鈴薯（Solanum tuberosum）和番茄（Solanum lycopersicum）HQT基因的相似度高達78%；與咖啡（Coffea canephora）和金銀花（Lonicera japonica）HQT基因的相似性分別為71%和67%，與朝鮮薊（Cynara cardunculus var.scolymus）HQT、HQT1和HQT2的相似性分別為66%、68%和66%。推測克隆的基因?qū)儆贖QT基因家族，命名為NtHQT1。

NtHQT1基因全長1 305 bp，編碼435個氨基酸。對煙草、馬鈴薯、番茄、咖啡、朝鮮薊及金銀花HQT蛋白序列進行比對，結果（圖2）顯示：不同植物的HQT編碼蛋白N端差異較大，這可能與N端多為物種特異性信號肽有關。通過MEME在線軟件尋找潛在的基序，與其他植物的HQT基因中得到的8個保守基序一致，進一步說明克隆到的基因?qū)儆贖QT基因家族。

煙草NtHQT1蛋白序列預測結果顯示：該蛋白的分子量是48.58 kDa，等電點為7.22，富含亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸等非極性氨基酸。有46個帶負電荷的氨基酸殘基和46個帶正電荷的氨基酸殘基。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為65.7%，預測其在哺乳動物體內(nèi)半衰期為30 h，在酵母中的半衰期大于20 h，表明NtHQT1蛋白不穩(wěn)定。平均總親水性系數(shù)（Grand average of hydropathicity）為-0.139，預測該蛋白為疏水性蛋白。對NtHQT1蛋白的跨膜區(qū)預測結果顯示：NtHQT1不存在跨膜結構域，表明不是膜蛋白。該蛋白的核定位信息預測結果顯示，NtHQT1蛋白沒有細胞核定位信息，推測該蛋白沒有定位在細胞核內(nèi)。NtHQT1的信號肽預測發(fā)現(xiàn)，不具有信號肽序列（信號肽序列指跨膜轉(zhuǎn)移的N端的氨基酸序列，一般存在于分泌型的蛋白中），這也說明HQT不是分泌型蛋白。在線軟件TargetP 1.0 Server分析表明，此蛋白既不是葉綠體轉(zhuǎn)運蛋白，也不是線粒體定位蛋白。結合跨膜分析和定位分析的結果，推測該蛋白可能在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

圖2 煙草NtHQT1蛋白與其他HQT蛋白多重序列比對

蛋白的二級結構（圖3）預測發(fā)現(xiàn)：NtHQT1蛋白與煙草HQT蛋白的二級結構類似，主要由螺旋、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲組成，其中延伸鏈主要在螺旋和隨機卷曲之間或者兩個螺旋之間起連接作用。NtHQT1蛋白質(zhì)的三級結構預測分析結果顯示，NtHQT1與羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/ quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）同源性最高，達61%。比對發(fā)現(xiàn)已經(jīng)報道的煙草HQT［15］與咖啡HCT氨基酸序列相似程度也較高，達76%，因此以HCT結構為模型構建NtHQT1的三級結構，見圖4。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的不同植物HQT的氨基酸序列，包括煙草、馬鈴薯、番茄、咖啡、金銀花、朝鮮薊等，用Clustal W進行相似性比對，然后用MEGA5軟件構建進化樹，結果見圖5。從進化樹上可以看出NtHQT1與煙草、番茄和馬鈴薯HQT的親緣關系較為接近。

2.3 不同植物激素對NtHQT1基因表達的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對煙草綠原酸的合成及積累有很大影響，萘乙酸（NAA）處理可降低綠原酸含量［18］，馬來酰肼（MH）處理可使其含量明顯升高［19］。經(jīng)6種植物激素（ABA，GA，MeJA，GR24，IAA和6-BA）分別處理移栽后4周的煙草幼苗的測定結果（圖6）顯示，MeJA、IAA、GR24、6-BA和GA能明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達，ABA對NtHQT1基因表達沒有顯著的上調(diào)作用。

圖3 HQT蛋白二級結構預測結果

圖4 HQT蛋白三級結構預測結果

圖5 植物NtbHLH93氨基酸序列進化樹

圖6 不同激素處理對NtHQT1基因表達的影響

3 結論與討論

研究發(fā)現(xiàn)HQT屬于BAHD乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族，該基因家族的酶利用底物?；o酶A催化生成不同的植物代謝產(chǎn)物［20］。HQT催化咖啡酰-CoA和奎尼酸生成綠原酸，敲除HQT基因能夠顯著降低煙草綠原酸的含量［15］。本試驗中通過同源克隆技術，成功地從普通煙草中克隆到一個新的HQT基因，命名為NtHQT1，雖然與已經(jīng)克隆的煙草HQT基因序列的相似性只有78%，但分析表明該基因具有HQT基因保守的結構域，是植物HQT基因家族的成員。在朝鮮薊中發(fā)現(xiàn)3個HQT基因，其相似性在70%左右［21］。根據(jù)NtHQT1和煙草中已經(jīng)克隆到的HQT基因的相似性，推測煙草中的HQT基因是一個基因家族。

NtHQT1基因受MeJA、IAA、GR24、6-BA和

GA的誘導上調(diào)表達。ABA對NtHQT1基因表達沒有顯著的上調(diào)作用。在山銀花上的研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在處于分化階段的細胞中含量最高，在細胞分化接近成熟時開始急劇減少，而在細胞趨于衰老時綠原酸含量最低［21］。IAA、GR24、6-BA和GA 4種植物生長調(diào)節(jié)激素都有促進植物生長和細胞分裂的作用，這與在山銀花中發(fā)現(xiàn)的在分化階段的細胞中綠原酸含量較高相一致。MeJA處理煙草可使生物堿和酚酸類物質(zhì)含量增加，以增強對昆蟲啃食的抵御［22］，這與本試驗中發(fā)現(xiàn)的MeJA處理煙草可使NtHQT1基因上調(diào)表達結果一致。ABA是調(diào)節(jié)干旱脅迫和鹽脅迫的重要激素［23］，ABA沒有明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達，推測干旱脅迫等可能不會上調(diào)綠原酸含量。因此，推測NtHQT1可能在煙草生長發(fā)育及抵抗病原菌侵染的過程中具有重要的作用。

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責任編輯 董志堅

Cloning and Expression Analysis of Chlorogenic Acid Biosynthetic GeneNtHQT1 fromNicotiana tabacum

WU Mingzhu,XU Yalong,LI Feng,WEI Pan,WANG Zhong,LUO Zhaopeng,WANG Ran, ZHANG Jianfeng,LIN Fucheng,and YANG Jun*
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China

Chlorogenic acid is the dominant polyphenol in leaf tobacco.Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase（HQT）is the key enzyme in the metabolic pathway of chlorogenic acid in plant.In order to study the function mechanism of HQT gene in the synthesis of chlorogenic acid in tobacco,a new HQT gene was cloned from Nicotiana tabacum by homologous cloning technology and named as NtHQT1.The results of bioinformatics analysis and expression pattern analysis of genes treated by different hormones showed that NtHQT1 cDNA was 1 305 bp in length and encoded 435 amino acids;it was a hydrophobic protein and located in cytoplasm,its secondary structure was mainly of helix and random coil.The expression of NtHQT1 gene was obviously up-regulated by methyl jasmonate（MeJA）, auxin（3-Indoleacetic acid,IAA）,strigolactone（GR24）,cytokinin（6-BA）and gibberellin acid（GA）, while not obviously affected by abscisic acid（ABA）.It suggested that NtHQT1 might play an important role in the course of growth,development and disease resistance of tobacco.

Nicotiana tabacum；Chlorogenic acid；NtHQT1；Cloning；Sequence analysis；Expression analysis

S572.01

A

1002-0861（2015）11-0001-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151101

2015-02-09

2015-07-28

中國煙草總公司鄭州煙草研究院院長科技發(fā)展基金項目“煙草甾醇合成相關轉(zhuǎn)錄因子NtbHLH93基因功能研究”（902013CA0330）。

武明珠（1983─），博士，工程師，主要從事煙草基因功能研究。E-mail：mingzhuwus@126.com；*

楊軍，E-mail：yangjun@ztri.com.cn

武明珠，許亞龍，李鋒，等.煙草綠原酸合成關鍵基因NtHQT1的克隆及表達分析［J］.煙草科技，2015，48（11）：1-6. WU Mingzhu，XU Yalong，LI Feng，et al.Cloning and expression analysis of chlorogenic acid biosynthetic gene NtHQT1 from Nicotiana tabacum［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：1-6.