水飛薊賓磷脂酰膽堿復(fù)合物與水飛薊賓對四氯化碳所致的小鼠肝損傷的保護(hù)作用比較

王煜,張愛蕓,張旭,呂凌

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 感染疾病科，寧夏 銀川 750004；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029)

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水飛薊賓磷脂酰膽堿復(fù)合物與水飛薊賓對四氯化碳所致的小鼠肝損傷的保護(hù)作用比較

王煜1,張愛蕓1,張旭1,呂凌2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 感染疾病科，寧夏 銀川 750004；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029)

目的 研究水飛薊賓磷脂酰膽堿復(fù)合物(SPC)與水飛薊賓對四氯化碳所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法 選擇100只健康成年的昆明小鼠，按照隨機(jī)數(shù)表法分為5組，每組20只，分別為水飛薊賓組、SPC-A組、SPC-B組、CCl4模型組以及正常對照組。5組小鼠通過測5組小鼠血清中的AST和ALT，對病理學(xué)切片進(jìn)行比較。結(jié)果 水飛薊賓組小鼠血清ALT及AST的含量與CCl4模型組相比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SPC-A組、SPC-B組小鼠的血清ALT及AST的含量也顯著低于CCl4模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SPC-A組、SPC-B組小鼠的血清ALT及AST的含量顯著低于水飛薊賓組(P<0.05)；SPC-B組的小鼠的血清ALT及AST的含量低于SPC-A組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝臟的病理學(xué)切片比較，正常對照組的切片是完全正常的；水飛薊賓組、SPC-A組、SPC-B組均能夠減輕小鼠的肝臟病理學(xué)的變化，其病理學(xué)變化小于CCl4模型組，且病理學(xué)變化幅度由小到大排序?yàn)檎φ战M、SPC-B組、SPC-A組、水飛薊賓組、CCl4模型組。結(jié)論 SPC和水飛薊賓都對四氯化碳所致的小鼠肝損傷的保護(hù)作用明顯，但是SPC功效更好，值得臨床進(jìn)一步研究。

水飛薊賓磷脂酰膽堿復(fù)合物；水飛薊賓；四氯化碳；肝損傷

水飛薊賓是水飛薊素中具有生物功效和活性的最為主要的組成成分。水飛薊賓是經(jīng)典的肝損傷修復(fù)藥物,其脂溶性和水溶性都很差，幾乎不溶于油脂和水。因此，在患者體內(nèi)的生物利用度很低,機(jī)體對其的吸收量也不穩(wěn)定,從而降低了水飛薊賓的臨床療效[3]。為進(jìn)一步提高水飛薊賓在應(yīng)用過程中的生物效能和利用度，水飛薊賓和磷脂酰膽堿的復(fù)合物應(yīng)運(yùn)而生，水飛薊賓磷脂酰膽堿復(fù)合物(silibinin phosphatidylcholine complex,SPC)是在水飛薊賓的基礎(chǔ)上合成的復(fù)合物[1-2]。其增大了水溶性和脂溶性，增強(qiáng)了人體的吸收。本文研究了(磷脂酰膽堿復(fù)合物)SPC和水飛薊賓對四氯化碳所致的小鼠肝損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇100只健康成年的雌性，昆明小白鼠，平均分為5組，每組20只，分別為水飛薊賓組、SPC-A組、SPC-B組、CCl4模型組以及正常對照組。所有小鼠體質(zhì)量均為(22.5±2.5)g，均來自寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號:醫(yī)動字432115)。水飛薊賓(購自哈藥六廠)；SPC(由南京制藥廠有限公司制備，純度98%)；將SPC以及水飛薊賓用0.5%的羧甲基纖維素鈉(即CMC-Na)(購自南京制藥廠有限公司)混勻配成10mg/mL及20 mg/mL的懸液作為備用。DATE BEHRING RXL的分析儀(飛利浦公司)。CCl4(購自重慶市化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.2 方法

1.2.1 建立模型：先將四氯化碳(CCl4)溶在大豆色拉油當(dāng)中，制得濃度為0.1%的溶液。在建立動物模型時，將四氯化碳(CCl4)溶液按照10 mL/kg對小鼠進(jìn)行腹腔注射，建立肝損傷的模型。

1.2.2 動物分組以及分組后的給藥方法：選擇100只昆明小鼠，5組小鼠同時按照以下方法連續(xù)進(jìn)行灌胃5 d，頻率1次/天，水飛薊賓組15 mg/mL的劑量,使用其混懸液進(jìn)行灌胃，10 mL/kg，SPC-A組和SPC-B組分別使用15 mg/mL、30 mg/mL的SPC的混懸液按照10 mL/kg的劑量進(jìn)行灌胃；正常對照組與CCl4組使用0.5%CMC-Na 10 mL/kg進(jìn)行灌胃。在第6天時，水飛薊賓組，SPC-A組，SPC-B組與模型組采用腹腔注射濃度為0.1%CCl4的溶液，具體的劑量設(shè)定參照10 mL/kg進(jìn)行，而正常對照組則采用大豆色拉油進(jìn)行腹腔注射。在注射藥物24 h以后(期間小鼠注藥后需先禁食12 h，可以自由飲水)，然后摘除小鼠的眼球。進(jìn)行采血2 mL，然后將所采血液按照10000 r/min進(jìn)行5 min的離心，然后分離所采血清，再使用生化分析儀對血清中的ALT和AST的活性進(jìn)行測定。肝臟活檢方法為：取每只小鼠大致相同位置的一小塊(大小約為0.5 cm×0.5 cm左右)肝組織，并將該肝組織通過石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行HE染色的步驟，并在光學(xué)顯微鏡下對肝細(xì)胞中出現(xiàn)的詳細(xì)損傷程度以及肝小葉的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，從而判定肝組織的損傷程度。

2 結(jié)果

2.1 各組ALT和AST值比較 水飛薊賓組的小鼠的血清ALT及AST的含量與CCl4模型組相比較，水飛薊賓組顯著低于CCl4模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SPC-A組、SPC-B組小鼠的血清ALT及AST的含量也顯著低于CCl4模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SPC-A組、SPC-B組小鼠的血清ALT及AST的含量顯著低于水飛薊賓組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SPC-B組的小鼠的血清ALT及AST的含量低于SPC-A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組ALT和AST值比較

▲P<0.05，與正常對照組相比，compared with control group；*P<0.05，與CCl4組相比，compared with CCl4group；#P<0.05，與水飛薊賓組相比，compared with silibinin group；△P<0.05，SPC-B組與 SPC-A組相比，SPC-B group compared with SPC-A group

2.2 肝組織的病理組織學(xué)的結(jié)果分析 制片成功后，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠肝組織的結(jié)構(gòu)完全正常，肝小葉的結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞有序排列，肝細(xì)胞的腫脹及脂肪未出現(xiàn)異常變性等情況；CCl4設(shè)定的模型組的小鼠的肝組織發(fā)生的改變最明顯，很大部分的肝小葉結(jié)構(gòu)不正常，小葉結(jié)構(gòu)不完整，相互之間分界不明顯，有犬牙交錯的態(tài)勢，肝細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)排列較為紊亂，肝細(xì)胞索出現(xiàn)了扭曲變形，肝細(xì)胞存在水腫，而且肝細(xì)胞其體積明顯增大，出現(xiàn)較為明顯的氣球樣變，并伴有炎癥細(xì)胞的浸潤(主要為中性粒細(xì)胞浸潤)，并伴有局部肝細(xì)胞的壞死等；水飛薊賓組，SPC-A組及SPC-B組的肝小葉均有輕度改變，肝細(xì)胞索的排列不夠整齊，肝細(xì)胞有部分發(fā)水腫，有少量的炎細(xì)胞浸潤，但其結(jié)果較CCl4模型組的情況改變程度小，尤以SPC-B組的病變程度為最輕，SPC-A組次之。見圖1。

圖1 各組肝組織病理學(xué)比較Fig.1 Comparison of liver tissue pathology in each group

3 討論

CCl4進(jìn)入動物的體內(nèi)之后，肝臟細(xì)胞色素P450會將其激活，生成三氯甲基自由基(CCl3·)[4-5]。CCl3·可以通過氫的吸附作用對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行攻擊，將生物細(xì)胞膜上的磷脂分子破壞，導(dǎo)致生物膜出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化，CCl3·繼而可與生物膜脂以及蛋白質(zhì)分子發(fā)生緊密的共價結(jié)合。這種結(jié)合進(jìn)而會導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)以及生物膜功能的完整性遭到破壞[6-7]。與此同時，CCl3·的產(chǎn)生還會抑制細(xì)胞膜以及微粒體膜上的鈣泵的活性，進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+離子內(nèi)流增加，進(jìn)一步引起細(xì)胞中毒死亡[8-9]。水飛薊賓減少CCl4的代謝將所生成的相應(yīng)的氧自由基激活，此外，還可對這些活性的自由基產(chǎn)生清除的作用[10-11]。從而導(dǎo)致CCl4對于脂質(zhì)的共價結(jié)合作用明顯的下降，減輕生物膜的損傷，從而減輕肝細(xì)胞的損傷程度[12]。水飛薊賓既能預(yù)防和治療病變，還能加速新的合成，從而減少了肝細(xì)胞的損傷和促進(jìn)了肝細(xì)胞修復(fù)與再生。

SPC是水飛薊賓的衍生物，由于其水溶性和脂溶性更大，因而生物利用度也更高[13]。SPC可以對CCl4所引起的急性肝損傷預(yù)防和治療,其作用機(jī)制是通過發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化的生物活性作用對肝細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行保護(hù)，從而穩(wěn)定和保護(hù)肝細(xì)胞的生物膜，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性,保持細(xì)胞膜的生物活性與效能。SPC是近年來新興的一種合成藥物，是由水飛薊賓和磷脂酰膽堿組成的復(fù)合物,其既繼承了水飛薊賓預(yù)防和治療病變作用，還能加速新的細(xì)胞膜合成，從而減少肝細(xì)胞的損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)與再生的效用，又增大了在體內(nèi)的水溶性和脂溶性，增加了生物利用度[14]。因此，水飛薊賓和磷脂酰膽堿的復(fù)合,對于藥物的抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化活性的效用變得更強(qiáng),因此SPC對于預(yù)防以及治療CCL4所引起的急性肝損傷效能更為明顯。

本研究顯示，預(yù)先采用SPC和水飛薊賓對小鼠進(jìn)行前期灌胃的相應(yīng)保護(hù)，可以明顯減輕小鼠在受到CCl4的毒性刺激后，出現(xiàn)的血清ALT、AST的活性升高，明顯降低活性提示小鼠的肝功能損傷較小。肝組織的病理組織檢查結(jié)果顯示，SPC和水飛薊賓均能減輕小鼠肝臟組織的損傷程度。表明SPC與水飛薊賓的應(yīng)用均對CCl4毒性刺激所導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷具有較為顯著的保護(hù)作用。相關(guān)研究也顯示，其臨床機(jī)理可能是通過抗脂質(zhì)過氧化作用實(shí)現(xiàn)的，從而保護(hù)肝細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。此外，水飛薊賓還能促進(jìn)肝臟組織細(xì)胞的DNA與其結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)與再生[7]。

綜上所述，SPC和水飛薊賓都對四氯化碳所致的小鼠肝損傷的保護(hù)作用明顯，但是SPC功效更好，值得臨床進(jìn)一步研究。

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(編校：譚玲)

Comparison of the protective effect of silibinin phosphatidylcholine complex and silibinin on mice liver injury by CCl4

WANG Yu1,ZHANG Ai-yun1,ZHANG Xu1,LV Ling2

(1.Department of Infectious Diseases, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004，China；2.Department of Medical Science, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the protective effect of silibinin phosphatidylcholine complex (SPC)and silibinin on mice liver injury by CCl4.Methods100 Kunming mice were randomly divided into five groups, 20 in each group, and they were divided into silibinin group, SPC-A group, SPC-B group, CCl4model group and normal control group.Their liver function (serum ALT and AST,comparison of liver pathology slice)were recorded and compared.ResultsCompared with the CCl4model group, serum ALT and AST of silibinin group were significantly lower than CCl4group, there were significant differences (P<0.05);serum ALT and AST of SPC-A group and SPC-B group were also significantly lower than CCl4model group,there were significantly different (P<0.05);serum ALT and AST of SPC-A group and SPC-B group were also significantly lower than silibinin group,there were significantly different (P<0.05); serum ALT and AST in SPC-B group of mice were less than SPC-A group, there were significant differences (P<0.05).Liver pathology slice were compared, slice of the normal control group was completely normal; in silibinin group, SPC-A group, SPC-B group the pathological changes in the liver of mice reduced, pathological changes in the above groups were less than CCl4model group, and the pathological changes extent were sorted the list by ascending counts,the order was the normal control group, SPC-B group, SPC-A group, silibinin group, CCl4model group. ConclusionThe protective effect of silibinin phosphatidylcholine complex (SPC)and silibinin are good mice with liver injury by CCl4,while SPC is better, it is worthy of further clinical study.

silibinin phosphatidylcholine complex; silibinin; carbon tetrachloride; liver injury

國家自然科學(xué)基金(81100270)

王煜，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：慢性肝病的診治，E-mail：qch1821460054@163.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0071-03