應(yīng)用IHA與競爭ELISA方法檢測豬瘟免疫抗體的比較與分析

湯海平　林永樂　林躍華　王藝娟（福建省漳州市動物疫病預(yù)防控制中心，福建漳州363000）

豬病防控Swine Disease Prevention and Control

應(yīng)用IHA與競爭ELISA方法檢測豬瘟免疫抗體的比較與分析

湯海平林永樂林躍華王藝娟
（福建省漳州市動物疫病預(yù)防控制中心，福建漳州363000）

摘要：通過對300份豬血清樣品應(yīng)用正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（競爭ELISA）方法進(jìn)行豬瘟免疫抗體檢測。采用IHA方法，以抗體效價(jià)≥25為合格標(biāo)準(zhǔn)時，其抗體合格率為95.3%；采用競爭ELISA方法，以阻斷率≤50%為陽性標(biāo)準(zhǔn)時，其抗體陽性率為93.6%，兩種檢測方法總體一致符合率93.0%，經(jīng)X2檢驗(yàn)，兩者差異不顯著，說明IHA方法和競爭ELISA方法皆可用于檢測豬瘟免疫抗體水平。

關(guān)鍵詞：豬瘟；免疫抗體；IHA；ELISA

豬瘟是國家要求強(qiáng)制免疫的動物疫病之一，疫苗免疫效果關(guān)系著豬群是否被保護(hù)而不受感染，因此，選擇正確的檢測方法對豬瘟免疫抗體效價(jià)進(jìn)行檢測并科學(xué)評估較為重要?；鶎荧F醫(yī)實(shí)驗(yàn)室通常采用正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)檢測豬瘟免疫抗體，而上層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室則多數(shù)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。為了獲得IHA和ELISA兩種檢測方法之間存在的關(guān)系，減少因檢測方法不同而出現(xiàn)的結(jié)果差異，筆者對300份豬血清樣品進(jìn)行豬瘟免疫抗體水平的平行對比檢測，并詳細(xì)比較這兩種常規(guī)檢測結(jié)果，為正確合理地評價(jià)豬瘟疫苗免疫抗體水平提供參考。

1　材料與方法

1.1免疫疫苗種類

豬瘟傳代細(xì)胞苗，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號：201402～201405。

1.2被檢血清

樣品來源于福建省漳州市各縣（市、區(qū)）抽檢的2014年秋季強(qiáng)制免疫過2次豬瘟疫苗的豬血液樣品300份，實(shí)驗(yàn)室分離血清，置4℃冰箱保存待檢。

1.3診斷試劑

豬瘟間接血凝抗體檢測試劑盒（配套有抗原、陽性血清、陰性血清及稀釋液）購自中國農(nóng)業(yè)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所診斷中心，批號：2014112105；豬瘟抗體ELISA檢測診斷試劑盒購自法國ID.VET公司，LOT：626。

1.4儀器設(shè)備

德國Brand單道、多道微量移液器；奧地利TECAN公司酶標(biāo)儀，型號為Infinite M200PRO。

1.5檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

IHA試驗(yàn)，依據(jù)《豬瘟診斷技術(shù)規(guī)程》（NY/SY 156-2000）和中國農(nóng)業(yè)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供的使用說明書進(jìn)行操作。判定標(biāo)準(zhǔn)：其免疫抗體≥1∶16（第4孔），呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格；按《2014年福建省動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》的通知文件要求，免疫個體在免疫21天后，抗體阻斷ELISA方法和抗體間接ELISA方法檢測抗體陽性即判定為合格，抗體正向間接血凝試驗(yàn)抗體效價(jià)≥25判定為合格，以文件要求作為此次判定標(biāo)準(zhǔn)。

ELISA試驗(yàn)按ID.vet公司的競爭ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測波長為450 nm，判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N（%）=ODsp/ODnc×100，S/N≤50%為陽性、50%＜S/N≤60%為可疑、S/N＞60%為陰性，本試驗(yàn)以S/N≤50%為陽性、合格，以S/N＞50%為陰性、不合格。

2　檢測結(jié)果

2.1豬瘟抗體IHA與競爭ELISA檢測結(jié)果的對比

在300份血清中，IHA方法檢測合格率為95.3% （286/300）；而ELISA方法檢測陽性率為93.6% （281/300）。兩種檢測方法合格（陽性）樣品一致符合率為95.4%（273/286）；樣品總符合數(shù)279份，一致符合率為93.0%（279/300），見表1。

表1　豬瘟抗體IHA與競爭ELISA檢測的對比結(jié)果（份))

2.2豬瘟抗體IHA的log2值與ELISA的阻斷率對比

根據(jù)IHA檢測抗體的log2值由低到高排序，對應(yīng)ELISA檢測抗體阻斷率，找出兩種檢測方法的共同合格（陽性）樣品數(shù)，計(jì)算陽性符合率，詳見表2。

表2　IHA的效價(jià)（log2值)與ELISA的陰陽性對比結(jié)果

2.3部分樣品IHA的log2值與ELISA的阻斷率比較

在抗體檢測過程中，發(fā)現(xiàn)三組數(shù)據(jù)有較明顯不同，序號1～10樣品為散養(yǎng)的中豬血清，豬瘟抗體IHA效價(jià)log2值為10，競爭ELISA的阻斷率在30%～45%之間；序號11～20樣品為規(guī)模豬場的母豬血清，IHA效價(jià)log2值為8，競爭ELISA的阻斷率在7.0%～8.0%之間；序號21～40樣品為散養(yǎng)的中豬血清，IHA效價(jià)log2值為3～8之間，競爭ELISA的阻斷率在8.0%～32.0%之間，詳見表3。

3　結(jié)果分析與討論

⑴從表1可以看出，按文件要求的判定標(biāo)準(zhǔn)時，IHA的檢測合格率為95.3%，比競爭ELISA的檢測陽性率（93.6%）高1.7個百分點(diǎn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)X2檢驗(yàn)，兩種檢測方法差異不顯著（＞0.05），說明IHA方法的合格率與競爭ELISA方法的合格率差異不明顯，其結(jié)果與戴愛玲等[1]、趙鑫[2]等的試驗(yàn)結(jié)果一致。兩種檢測方法的樣品總符合數(shù)279份，總符合率為93.0%，合格（陽性）樣品符合率95.4%，結(jié)果表明，總體上符合率均達(dá)到93%以上，兩者有很好相關(guān)性，這與何雁南等的試驗(yàn)結(jié)果一致[3]。

⑵從表2可以看出，在IHA抗體log2值升序的各個區(qū)域值，競爭ELISA抗體檢測結(jié)果均出現(xiàn)陽性和陰性，但兩者合格（陽性）符合率很高，在91.7%～100%之間；另外競爭ELISA檢測抗體陽性符合率并沒有隨著IHA抗體log2值的升高而升高，說明兩種方法之間還是存在一些不一致性。

⑶從表3中分析三組IHA和競爭ELISA的檢測數(shù)據(jù)差異甚大的原因，主要是與疫苗劑量和免疫后抽血間隔時間有關(guān)。序號1～10的樣品是免疫2.5頭份疫苗（兩次免疫劑量一樣）的中豬血清，抽血時間距最后一次免疫僅間隔20天，產(chǎn)生的中和抗體水平很高（10 log2值），但產(chǎn)生抗E2蛋白抗體水平則一般，競爭ELISA檢測阻斷率較高（30%～45%）；序號11～20的樣品是免疫4頭份疫苗（跟胎免疫）的母豬血清，多次免疫后產(chǎn)生的中和抗體水平也是很高（8 log2值），抗E2蛋白抗體水平也高，體現(xiàn)在競爭ELISA檢測阻斷率很低（6.0% ～8.0%）；序號21～40的樣品是免疫1.5頭份疫苗（兩次免疫劑量一樣）的中豬血清，抽血時間距最后一次免疫間隔50天，由于免疫劑量僅為1.5頭份，產(chǎn)生的中和抗體水平不是很高（3～8 log2值之間），且參差不齊，產(chǎn)生抗E2蛋白抗體水平則不錯，競爭ELISA檢測阻斷率較低（8.0%～50.0%），也參差不齊。這三組試驗(yàn)結(jié)果表明IHA與競爭ELISA更沒有特定相關(guān)性[1,4]。

⑷本次試驗(yàn)結(jié)果表明，采用IHA方法檢測豬瘟免疫抗體合格率略高于競爭ELISA檢測的陽性率，是因?yàn)镮HA和競爭ELISA檢測方法原理機(jī)制有所不同，IHA檢測的是豬瘟疫苗免疫后血清中的全病毒抗體，競爭ELISA檢測的是血清中E2蛋白產(chǎn)生的抗體。全病毒抗體可能是含有其他抗體的中和抗體，如BVDV抗體等；抗E2蛋白抗體則是豬瘟疫苗免疫后產(chǎn)生的，是豬瘟病毒的主要抗原蛋白,具有種屬特異性，因此，血清中全病毒抗體的量會多于單一抗體。

表3　部分IHA的log2值與ELISA的阻斷率比較

4　小結(jié)

⑴通過本次試驗(yàn)比較,一方面，IHA的檢測合格率95.3%高于ELISA的檢測陽性率93.6%，兩種檢測方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，說明IHA與競爭ELISA檢測方法有很好的相關(guān)性[1]，但另一方面，單個樣品中也會存在明顯差異，證實(shí)兩者之間沒有特定關(guān)聯(lián)性[4]。

⑵本試驗(yàn)結(jié)果表明，基層采用IHA方法評價(jià)豬瘟免疫抗體是可行的，但因肉眼判定，主觀性誤差較大，而ELISA檢測由儀器自動讀取，誤差?。粡脑\斷試劑的穩(wěn)定性上看，ELISA試劑性能穩(wěn)定、重復(fù)性好，IHA試劑性能不夠穩(wěn)定，重復(fù)性差[1,2,4]；即兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，要因地制宜采用。

參考文獻(xiàn)

[1]戴愛玲,要曉華,楊小燕,等.間接血凝試驗(yàn)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測豬瘟抗體的比較.見:福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會.福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集[C].福州:福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所. 2009. 123-125.

[2]趙鑫,趙明娟,高洋,等.兩種檢測豬瘟免疫抗體實(shí)驗(yàn)對比試驗(yàn)[J].當(dāng)代畜牧, 2014(9):53-54.

[3]何雁南,欒后利,董曉輝,等.檢測豬瘟抗體間接ELISA方法的建立及應(yīng)用[J].養(yǎng)殖與飼料, 2007(7):5-8.

[4]王治方,郭成留,張清華,等.兩種不同方法對豬瘟免疫效果評估對比試驗(yàn)[J].中國畜牧獸醫(yī), 2007, 34(9):99-100.

中圖分類號：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4645(2015)10-0047-03

收稿日期：2015-05-22

作者簡介：湯海平（1965-），漢族，福建云霄人，高級獸醫(yī)師，長期從事動物臨床獸醫(yī)和實(shí)驗(yàn)室檢測工作，E-mail:thp2@163.com