脂氧素在對(duì)乙酰氨基酚所致急性肝損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制研究

李世清,杜宗漢,周曉晴,羅君,安啟嫻,靳斌

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，南充市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 南充 637000；2.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650032；3.山東大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濟(jì)南 250100)

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脂氧素在對(duì)乙酰氨基酚所致急性肝損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制研究

李世清1,杜宗漢1,周曉晴1,羅君1,安啟嫻2,靳斌3

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，南充市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 南充 637000；2.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650032；3.山東大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濟(jì)南 250100)

目的 探討脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)在對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷中的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 100只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組、對(duì)乙酰氨基酚組(PCM組)、N-乙酰半胱胺酸組(NAC組)和脂氧素A4組(LXA4組)4組，每組25只。除空白組兔外給其他3組兔對(duì)乙酰氨基酚灌胃24 h后NAC組靜脈注射N(xiāo)AC，LXA4組靜脈注射LXA4，36 h后，麻醉動(dòng)物取肝臟組織進(jìn)行免疫組化及RT-PCR分析并檢測(cè)肝組織中TNF-α和IL-10的表達(dá)，Western blot檢測(cè)NF-κB p65的表達(dá)。結(jié)果 PCM組NF-κB p65的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，NAC、LXA4治療組NF-κB p65的表達(dá)顯著低于PCM組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-α mRNA水平高于脂氧素A4組和空白對(duì)照組(P<0.05)。脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)乙酰氨基酚組(P<0.05)。結(jié)論 脂氧素A4 通過(guò)抑制對(duì)乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中NF-κB p65的活化，下調(diào)促炎因子TNF-α基因的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10基因的表達(dá)，從而控制炎癥反應(yīng)進(jìn)程，繼而發(fā)揮其肝臟保護(hù)作用。

對(duì)乙酰氨基酚；急性肝損傷；脂氧素A4

對(duì)乙酰氨基酚是目前臨床上仍廣泛使用的退熱鎮(zhèn)痛藥。在正常的治療劑量之下其副作用較為少見(jiàn)，因而通常被認(rèn)為是一種比較安全的藥品，但短時(shí)間內(nèi)大量服用則會(huì)引肝臟損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致肝功能衰竭甚至死亡[1-2]。在我國(guó)，對(duì)乙酰氨基酚廣泛應(yīng)用于感冒所致的發(fā)熱、頭痛的藥物。發(fā)達(dá)國(guó)家中對(duì)乙酰氨基酚肝中毒是急性肝功能衰竭所致死亡最為常見(jiàn)的原因之一。因此，近年來(lái)，該藥的過(guò)量使用和濫用所引起的不良反應(yīng)和嚴(yán)重的肝臟毒性越發(fā)引起臨床和基礎(chǔ)研究者的關(guān)注[3]。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)是脂氧素(lipoxins，LXs)家族的一員，其對(duì)多種炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，常被稱(chēng)為炎癥反應(yīng)的“剎車(chē)信號(hào)”，或者“停止信號(hào)”，此外，脂氧素A4在機(jī)體的免疫調(diào)解中同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用。脂氧素A4在多種組織器官的缺血再灌注中具有保護(hù)作用，同時(shí)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)。本文使用灌胃法成功建立對(duì)乙酰氨基酚中毒的新西蘭大白兔模型。在對(duì)乙酰氨基酚中毒后期使用脂氧素A4治療，觀察脂氧素A4對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚中毒兔肝臟損傷的保護(hù)作用，探討脂氧素A4在對(duì)乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性新西蘭大白兔100只(編號(hào)：16655759268231)，體質(zhì)量為2.5～3.0kg，SPF級(jí)，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)前自由飲水，禁食24 h。

1.1.2 主要試劑：甲酯化脂氧素A4(Cayman，美國(guó))；水合氯醛(北京化學(xué)試劑公司)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(天津市化學(xué)試劑研究所)；N-乙酰半胱氨酸(寧波科瑞生物工程有限公司)；對(duì)乙酰氨基酚(上海施貴寶制藥)；TNF-α 免疫組化S-P 試劑盒、IL-10 免疫組化S-P 試劑盒、NF-κB p65免疫組化S-P 試劑盒(英國(guó)Abcam 公司)；TUNEL 檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim 公司)；PBS 粉劑(北京中杉金橋公司)。多聚甲醛(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；無(wú)水乙醇(江陰市瑞通化工貿(mào)易有限公司)，NF-κB p65和Anti-β-actin 抗體(Santa cruz)，辣根過(guò)氧化物酶(北京中杉金橋公司)。

1.1.3 主要設(shè)備：手提式壓力滅菌消毒器(上海申安醫(yī)療器械廠)；YJ-875S 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；SZ-97 自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；M-6 離心機(jī)(美國(guó)Beckman 公司)； HJ-3 磁力攪拌器(深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司)；Eppendorf 1000 μL，200 μL，10 μL 自動(dòng)移液器(德國(guó)Eppendorf 公司)；電子天平(AE200 型，瑞典梅特勒-托利多儀器有限公司)；BS60 三用恒溫水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；300 ℃恒溫烘箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；HQ45 恒溫?fù)u床(中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠)；微波爐(順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司)；YL3 回轉(zhuǎn)式切片機(jī)(北京手術(shù)器械廠產(chǎn)品)；OLMPUS AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本OLMPUS公司)；UV-754 紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：100只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，每組25只。常規(guī)麻醉后，空白對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；對(duì)乙酰氨基酚組(PCM組)給予對(duì)乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)；N-乙酰半胱胺酸組(NAC組)在對(duì)乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)24 h后，給予負(fù)荷劑量的N-乙酰半胱胺酸(140 mg/kg)靜脈注射治療；脂氧素A4 組(LXA4)在對(duì)乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)24 h后，給予脂氧素A4(1.5 μg/kg)靜脈注射；各組兔均在灌胃后36 h后進(jìn)行組織標(biāo)本制備，并進(jìn)行生化分析。

1.2.2 Western blot檢測(cè)各組兔肝臟組織內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)：將30～60 μg樣品放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，4 ℃條件下轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。轉(zhuǎn)膜完成后，將硝酸纖維素膜封閉液封閉，室溫輕搖1 h。一抗反應(yīng)：加入用封閉液稀釋的一抗10 mL(抗NF-κB p65、actin特異抗體，1:1000稀釋)，4 ℃輕搖過(guò)夜或者室溫2 h。漂洗濾膜3次，每次10 min。二抗反應(yīng)：將膜用封閉液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體(稀釋濃度為1:2000)，室溫輕搖1 h。漂洗濾膜3次。ECL法顯色 ：將等體積ECL試劑A液、B液，混合均勻加到轉(zhuǎn)印膜上，反應(yīng)5 min。暗室曝光，曝光1～2 min，顯影、定影，自來(lái)水充分沖洗。蛋白質(zhì)定量分析： X光片用Mixrotek ScanWizard 5掃描軟件進(jìn)行電腦掃描、Quantity one 7.0圖像分析軟件作灰度分析。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)肝臟組織中TNF-α及IL-10 mRNA 表達(dá)：引物 TNF-α(90bp)：5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCA-TTGC-3′，5′ACATTCGA-GGCTCCAGTGAATTCGG-3′；IL-10(100bp)：5′-CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG-3′，5′-TGTCTAGGTCCTGG-AGTCCAGCAGA-3′；β-actin：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCAT-GAAAC-3′，5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。

采用20 μL PCR 反應(yīng)體系:純水12 μL，10×PCR緩沖液2 μL，25mMMgCl21 μL，10mM dNTP 0.5 μL，10 μM的上、下游引物各1 μL，Taq聚合酶1 U，DNA模板2.5 μL。PCR循環(huán)條件為: 94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸50 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker為參照鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)NF-κBp65的表達(dá)：①組織切片脫蠟、水化、PBS洗2～3次；②滴加3%H2O2(80%甲醇)室溫靜置10 min；③PBS洗2～3次后抗原修復(fù)；④PBS洗2～3次滴加正常山羊血清封閉液，20 mn后甩去多余液體；⑤滴加Ⅰ抗(抗NF-κB p65、actin特異抗體，1:1000稀釋)37 ℃1 h，PBS洗3次；⑥滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗(稀釋濃度為1:2000，加入0.05%的Tween-20)；⑦PBS洗3次，DAB顯色，鏡下掌握染色程度；⑧自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化；⑨自來(lái)水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判斷：根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)，并分別記分：陰性細(xì)胞(-)無(wú)顯色；弱陽(yáng)性細(xì)胞(+)顯色為淺黃色；中度陽(yáng)性細(xì)胞(++)顯色為棕黃色；強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞(+++)顯色為棕褐色。

1.2.5 肝臟細(xì)胞凋亡的TUNEL試劑盒檢測(cè)：細(xì)胞固定、浸洗；加入Proteinase K處理細(xì)胞15 min，浸洗; 4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min,浸洗；細(xì)胞中加平衡液，濕盒平衡10 min；后滴加TUNEL反應(yīng)混合液：加TUNEL反應(yīng)混合溶液；暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h、浸洗；之后加轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒37 ℃×30 min，浸洗；加入DAB顯色(避光)，鏡下觀察顯色情況；去離子水沖洗，蘇木精復(fù)染；自來(lái)水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定：細(xì)胞核固，縮有的呈碎片狀，不規(guī)則，大小不一致，呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組肝臟組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組比較，PCM組中NF-κBp65的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而與PCM組相比，NAC、LXA4治療組NF-κB p65的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，PCM組NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)率最高，NAC組次之，脂氧素A4組較低，而空白對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率最低。見(jiàn)圖2。

圖1 肝臟組織中NF-κB p65的表達(dá)#P<0.01，與對(duì)照組比較；*P<0.01，與PCM組比較Fig.1 Expression of NF-κBp65 in liver tissue#P<0.01，compared with control group；*P<0.01，compared with PCM group

圖2 肝組織NF-κB p65表達(dá)陽(yáng)性率(×400)#P<0.01，與對(duì)照組組比較；*P<0.05，與PCM組比較Fig.2 Expression of NF-κBp65 positive rate in liver tissue(×400)#P<0.01，compared with control group；*P<0.05，compared with PCM group

2.2 肝臟組織中TNF-α、IL-10表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-αmRNA水平顯著升高，明顯高于脂氧素A4組N-乙酰半胱氨酸組和空白對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相反地，脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)乙酰氨基酚組，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。免疫組化結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相符合，與對(duì)乙酰氨基酚組比較，LXA4組中TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，而IL-10陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3，4。

表1 細(xì)胞因子TNF-αmRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)Tab.1 Expression of cytokines TNF-α and ±s)

#P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group；*P<0.05，與PCM組比較，compared with PCM group

圖4 肝組織IL-10 表達(dá)陽(yáng)性率(×400)#P<0.05，與對(duì)照組比較；*P<0.05，與PCM組比較Fig.4 The positive rates of IL-10 expression in liver tissue(×400)#P<0.05，compared with control group；*P<0.05，compared with PCM group

3 討論

本研究通過(guò)建立兔急性對(duì)乙酰氨基酚中毒模型，探討了脂氧素A4在對(duì)乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中可能的保護(hù)機(jī)制。研究結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組比較，對(duì)乙酰氨基酚組(PCM組)中NF-κB p65的表達(dá)顯著升高，而在脂氧素A4(LXA4)治療組中，NF-κB p65的表達(dá)顯著降低。于此同時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-α mRNA水平顯著升高，明顯高于脂氧素A4組和空白對(duì)照組。相反，脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)乙酰氨基酚組。該研究結(jié)果提示，脂氧素A4可能通過(guò)抑制NF-κB p65的活化，下調(diào)了促炎因子的表達(dá)而上調(diào)了抑炎因子的表達(dá)，從而控制了肝損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)進(jìn)程，從而發(fā)揮其肝臟保護(hù)作用。

研究證實(shí)LXA4對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用不僅僅局限于腎臟。實(shí)際上，ATL可以抑制由于肢體缺血再灌注引起的肺內(nèi)PMN浸潤(rùn)，表明LXA4和ATL可以阻止應(yīng)激反應(yīng)，如在圍手術(shù)期藥物使用過(guò)程中觀察到的一樣。在此過(guò)程中，LXA4和ATLa可減少兔肝臟細(xì)胞缺血再灌注誘導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子(CINC)-1表達(dá)水平[4]。另外，在阻塞大腦中動(dòng)脈引起的短暫性局部腦缺血兔模型中，經(jīng)腦室給與LXA4類(lèi)似物可以減小梗塞體積，減輕神經(jīng)系統(tǒng)體征。促炎癥因子TNF-β1和IL-1β的下調(diào)可以在缺血腦組織中觀察到[5]。LXA4-IL10軸似乎在缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制中扮演著相關(guān)角色，因?yàn)長(zhǎng)XA4并不能減輕IL-10缺乏小鼠的炎癥和組織損傷[6]。此外，眾多研究顯示LXA4通過(guò)抑制NF-κB p65的活性來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。有學(xué)者[7-9]研究顯示在兔心跳驟停復(fù)蘇后，LXA4可以通過(guò)抑制NF-κB p65的活性而減輕心肌組織中的炎癥反應(yīng)，從而減輕兔心肌損傷，提高其存活率。此外，有研究顯示，LXA4可以通過(guò)抑制NF-κB p65的活化而減輕巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[10]。本研究中，LXA4通過(guò)抑制NF-κB p65的活化，下調(diào)了促炎因子TNF-α的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了抗炎因子IL-10的表達(dá)，從而減輕了肝臟組織中的炎癥反應(yīng)進(jìn)程。眾多的研究證實(shí)，LXA4可以發(fā)揮明顯的抗炎效應(yīng)，其可以通過(guò)抑制NF-κB p65的活化進(jìn)而抑制促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8，以及血小板活化因子(PAF)的表達(dá)[10-12]。NF-κB p65作為轉(zhuǎn)錄因子，其也可以調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促凋亡作用[13-15]。前一部分研究也顯示，LXA4治療組中肝細(xì)胞的凋亡明顯減輕，這或許與LXA4抑制了NF-κB p65的活化有關(guān)。

脂氧素A4可以抑制對(duì)乙酰氨基酚中毒所致肝損傷中NF-κB p65的活化，繼而抑制促炎因子TNF-α基因的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10基因的表達(dá)，從而控制急性肝損傷中的炎癥反應(yīng)進(jìn)程，從而發(fā)揮其保護(hù)作用[16]。

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(編校：王儼儼，譚玲)

Role of lipoxin in preventing paracetamol-induced acute hepatic injury and its mechanism

LI Shi-qing1,DU Zong-han1,ZHOU Xiao-qing1,LUO Jun1,AN Qi-xian2,JIN Bin3

(1.Department of Gastroenterology, Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Municipal Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, China; 2.Department of Gastroenterology, The Second People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, China; 3.Department of Clinical Medicine, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

ObjectiveTo investigate the potential role of the lipoxin A4 in preventing paracetamol (PCM)-induced hepatic injury, and reveal its possible related signal path.Methods100 adult male New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups, 20 rabbits in each group: Control group; PCM group; NAC group; LXA4 group; LXA4+NAC group.The rabbits were treated with paracetamol for 36 h by gastric lavage, then given NAC of NAC group,LXA4 of LXA4 group,after 24 h,the rabbits anesthetized were removed liver in which TNF-αand IL-10 were analyzed by immunohistochemistry and RT-PCR method.The expression of NF-κB p65 were detected by Western blot.ResultsThe activation of NF-κB p65 was inhibited by lipoxin A4 in patients of paracetamol-induced hepatic injury, and the expression of NF-κB p65 significantly decreased in LXA4 group compared with PCM group with statistically significant difference (P<0.01).What’s more, the expression of TNF-α and TNF-αmRNA in liver of LXA4 group decreased, conversely, IL-10 mRNA levels increased significantly, and there were statistical differences, respectively (P<0.01). ConclusionLipoxin A4 could control inflammation in paracetamol-induced acute heaptic injury via activation inhibition of NF-κB p65, down regulation of proinflammatory cytokine TNF-α level and up regulation of anti-inflammatory cytokine IL-10, which manifests a protective effect on liver protection.

paracetamol; acute hepatic injury; lipoxin A4

山東省自然科學(xué)基金(Y2008C10)

李世清，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤及癌前狀態(tài)疾病、慢性肝病的防治，E-mail：lsq18258062152@126.com。

R575.3

A

1005-1678(2015)02-0088-04