丁苯酞對血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬神經(jīng)元代謝產(chǎn)物的影響

孫曉鳴,鮑君杰,張華,趙合慶,張彩元,朱莉萍

(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000；3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 磁共振室，江蘇 蘇州 215000；4.華中科技大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430000)

?

丁苯酞對血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬神經(jīng)元代謝產(chǎn)物的影響

孫曉鳴1,鮑君杰1,張華1,趙合慶2,張彩元3,朱莉萍4

(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000；3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 磁共振室，江蘇 蘇州 215000；4.華中科技大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430000)

目的 探究丁苯酞(3-N-butylphthalide，NBP)對血管性癡呆(vascular dementia，VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元代謝產(chǎn)物的影響。方法 90只健康雄性SD大鼠，隨機選取10只為假手術(shù)組，其余80只用2VO法制作大鼠VD模型。術(shù)后8周共存活48只大鼠，隨機分為VD模型組、NBP低劑量組、NBP中劑量組、NBP高劑量組4組，每組各12只。術(shù)后8周NBP低、中和高劑量組大鼠分別腹腔注射NBP12.5、25和50 mg/(kg·d)，VD模型組和假手術(shù)組則注射相同體積的0.5%Tween-80溶液，所有大鼠均連續(xù)注射4周。采用定位航行試驗和空間探索試驗考察各組大鼠行為學(xué)變化，1H-MRS法檢測神經(jīng)元代謝產(chǎn)物變化。結(jié)果 定位航行試驗結(jié)果表明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與DBP劑量成正比，即1～5 d，NBP中、高劑量組的平均逃離潛伏期低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空間探索試驗結(jié)果表明DBP高劑量組能夠顯著改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；1H-MRS檢測結(jié)果表明與給藥后VD 模型組相比，NBP中、高劑量組NAA/Cr、Cho/Cr和mI/Cr與模型組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明中、高劑量NBP對海馬內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生有明顯促進作用，而NBP低劑量組則無明顯作用。結(jié)論 丁苯酞可以對血管性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記能力起到改善作用，通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元代謝產(chǎn)物，達到改善VD作用。

丁苯酞；血管性癡呆；水迷宮；海馬神經(jīng)元代謝

腦血管疾病在我國已成為造成死亡的第一殺手[1]，它引起的腦卒中通常能在很短時間內(nèi)導(dǎo)致血管性癡呆(vascular dementia，VD)的發(fā)生[2]。丁苯酞(3-N-butylphthalide，NBP)，又稱芹菜甲素，化學(xué)名消旋-3-正丁苯酞，是我國自主研制的國家一類新藥[3-4]，它提取自天然植物水芹菜籽并消旋合成為黃色油狀液體，具有良好的抗缺血作用，是一種對防治VD具有很好應(yīng)用前景的新藥之一[5-6]。它通過保護缺血腦組織、減輕腦水腫，改善腦能量代謝、改善缺血腦區(qū)的微循環(huán)，抑制神經(jīng)細胞凋亡，抗腦血栓形成、抗血小板聚集作用，抑制炎癥損傷，抑制谷氨酸釋放，抑制細胞內(nèi)鈣超載，抑制自由基和提高抗氧化酶活性等機制而發(fā)揮藥物療效[7]。目前對NBP的研究多集中在抗腦缺血領(lǐng)域，但它對VD 的相關(guān)治療作用尚未十分明確[8]。本實驗主要通過NBP對VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的考察，1H-MRS評估VD 大鼠海馬內(nèi)代謝物的變化進行探討，以期為臨床治療VD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：90只健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，經(jīng)湖北省實驗動物質(zhì)量檢測站檢測合格，實驗動物合格證編號為：No.4200592799。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 藥品與試劑：NBP原液(石家莊藥業(yè)集團恩必普藥業(yè)有限公司提供)，臨用前以0.5%Tween-80 配成乳劑。注射用青霉素鈉(悅康藥業(yè)集團北京凱悅制藥有限公司)；吐溫80(上海廣諾化學(xué)科技有限公司)；水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠)；3%～5%苦味酸溶液(深圳三利化學(xué)品有限責任公司)；無水乙醇，4%的戊二醛溶液(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；4%多聚甲醛溶液(武漢谷歌生物科技有限公司)；伊紅、蘇木精、石蠟、二甲苯、PBS緩沖液、鋨酸、丙酮和檸檬酸鉛(廣州化學(xué)試劑廠)；中性樹膠(北京康為世紀生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉(天津市永生化工有限公司)；磷酸二氫鈉(天津市博迪化工有限公司)；PON 812環(huán)氧樹脂(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器P：7.0 T 磁共振波譜儀 BioSpec70/20(德國Bruker 公司)；Morris 水迷宮(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供)；SMART 行為學(xué)視頻分析軟件(西班牙Pa NBP高劑量ab公司)；XYC型鼠斷頭器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；精度在0.01 mg的電子天平(上海精密儀器實驗設(shè)備有限公司)；Milli-Q6型超純水系統(tǒng)(美國MJ Research公司)；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密儀器實驗設(shè)備有限公司)；DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 分組：90只健康雄性SD大鼠，隨機抽出10只為假手術(shù)組，其余80只用2VO法[12]制作大鼠VD模型。其中假手術(shù)組大鼠只分離雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎，其余4 組均行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎。術(shù)后8周共存活48只VD模型大鼠，再將其隨機分為4組：VD模型組、NBP低劑量組、NBP中劑量組、NBP高劑量組，每組各12只。

1.2.2 給藥：術(shù)后8周開始腹腔注射給藥。NBP用0.5%Tween-80助溶，配制成濃度為10 mg/mL的溶液。NBP低劑量組、中劑量組和高劑量組的注射劑量分別為12.5、25、50 mg/(kg·d)，VD模型組和假手術(shù)組則注射相同體積的0.5%Tween-80溶液，所有大鼠均連續(xù)注射4周。

1.2.3 檢測指標：行為學(xué)測試[3]：腹腔注射給藥4周后，用Morris水迷宮進行定位航行試驗和空間探索試驗，記錄前5 d的逃避潛伏期和第6天的跨越原平臺位置次數(shù)。

1H-MRS檢測[7]：大鼠的1H-MRS檢測在中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所進行。檢測分2個時間點進行，第1個時間點為術(shù)后8周進行腹腔注射給藥之前，第2個時間點為行為學(xué)檢測結(jié)束后1周。檢測大鼠海馬區(qū)NAA、Cr、Cho、mI峰的積分面積，并計算NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr的比值。

2 結(jié)果

2.1 定位航行試驗結(jié)果 與VD模型相比，1～5 d，假手術(shù)組，NBP中、高劑量組之間的平均逃離潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而NBP低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義；1～5 d，NBP高、中和低劑量組之間平均逃離潛伏期表現(xiàn)為隨著劑量的增加，平均逃離潛伏期縮短，即NBP高劑量組的平均逃離潛伏期最短。見表1。

表1 各組大鼠定位航行試驗結(jié)果±s)Tab.1 Result of place navigation ±s)

*P<0.05，與VD模型組相比，compared with VD model group

2.2 空間探索試驗結(jié)果 與VD模型組相比，假手術(shù)組，NBP中、高劑量組之間跨越原平臺位置次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且跨越原平臺位置的次數(shù)表現(xiàn)為隨著劑量的增加，跨越原平臺位置的次數(shù)增多，即NBP高劑量組的跨越原平臺位置的次數(shù)最多。表明大劑量NBP治療對VD 大鼠的空間記憶能力有比較明顯的改善效果。見表2。

表2 各組大鼠跨越原平臺位置次數(shù)±s，次)Tab.2 The number of crossing the original platform of each ±s，times)

*P<0.05，與VD模型組相比，compared with VD model group

2.3 大鼠海馬的1H磁共振波譜的檢測 與給藥前相比，VD模型組給藥后的NAA/Cr顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明海馬神經(jīng)元的功能隨著缺血時間的持續(xù)進一步下降；Cho/Cr升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明海馬內(nèi)仍有細胞損傷發(fā)生；mI/Cr差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明海馬內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生不明顯。見表3。

表3 VD模型組給藥前后NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr比較Tab.3 Comparison of NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr in model group before and after ±s)

*P<0.05，與給藥前VD模型組相比，compared with model group before treatment

與給藥后VD模型組相比，假手術(shù)組與NBP中、高劑量組之間的NAA/Cr、Cho/Cr和mI/Cr差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而NBP低劑量組無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。表明中劑量組和高劑量組對海馬內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生有明顯促進作用，而NBP低劑量組則無此作用，見表4。

表4 各組NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr的比較Tab.

*P<0.05，與給藥后VD模型組相比，compared with VD model group after treatment

2.41H-MRS檢測NAA、Cho和mI與Cr的質(zhì)譜圖 給藥前大鼠1H MRS的Cho、NAA、Cr的波峰高聳，Glx及mI的波峰略低，Lac波峰低平，給藥以后NAA峰明顯下降，Lac波峰明顯增高呈典型的倒置雙峰狀。

圖1 給藥前和給藥后NAA、Cho和mI與Cr的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrogram of NAA，Cho and mI and Cr administration before and after drug administration

3 討論

Morris水迷宮試驗廣泛應(yīng)用于研究動物的行為學(xué)表現(xiàn)[9]。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)通過Morris水迷宮實驗的訓(xùn)練對大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力有所提高，但重復(fù)性的Morris水迷宮訓(xùn)練卻只會對提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力有幫助而對提高大鼠的空間記憶能力沒有明顯作用[10]。通過這一發(fā)現(xiàn)對動物的行為學(xué)研究有著重要的啟示，看來只有當外界的刺激能夠影響到動物的空間記憶能力的時候，才會對動物的長期行為產(chǎn)生直接的影響，換而言之空間記憶有助于產(chǎn)生長期記憶效果。

NAA主要存在于神經(jīng)元及軸索中，是目前波譜研究中最重要的神經(jīng)元標志物之一，其含量的變化可反映神經(jīng)元的功能狀況，其濃度下降確實伴有神經(jīng)元的損傷，是神經(jīng)元功能受損的標志[11]。也有相關(guān)研究證實，中心區(qū)域NAA含量的減少可作為腦梗塞發(fā)生的標志[12]。Cho主要來源于腦內(nèi)磷酸膽堿和磷脂酰膽堿等膽堿物質(zhì)的代謝產(chǎn)物，此類物質(zhì)主要參與細胞膜的構(gòu)成，故Cho含量的改變可反映細胞膜的合成與代謝變化。腦缺血時Cho和NAA的峰值都會降低，但Cho減少不如NAA顯著[13]。目前普遍認為Cho峰的變化是在MRS上用于鑒別腦梗塞與惡性腦腫瘤的標志[14]。mI只存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)，被認為是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志[15]，mI含量的變化可反映神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生情況，是神經(jīng)恢復(fù)的主要表現(xiàn)之一。

在本研究中，在造模8周后，VD模型組NAA含量較假手術(shù)組有明顯下降，其降幅相比Cr和Cho更大。行大鼠NBP腹腔注射4周后再次行各組的MRS檢查發(fā)現(xiàn)模型對照組和用藥前NAA峰值相比有所下降，說明VD模型的神經(jīng)功能有進一步下降。NBP小劑量組的NAA峰也和VD模型組區(qū)分不大，但NBP中劑量和高劑量組的NAA峰明顯回升。又因為NAA是反映神經(jīng)功能的標志，說明足量NBP對神經(jīng)功能的恢復(fù)和保護有一定的作用。本研究中VD模型組和NBP低劑量組NAA/Cr確實比Cho/Cr要大，與上述報道一致的[13]。由于大多數(shù)腦腫瘤的MRS表現(xiàn)為NAA峰的降低，并且隨著腫瘤惡性程度的升高也可能出現(xiàn)Lac峰，但Cho峰的表現(xiàn)卻是增高的，在臨床上鑒別腦梗塞與腦腫瘤需要將Lac峰和Cho峰結(jié)合起來分析，同時可以把出現(xiàn)Lac峰，而Cho峰無明顯變化或降低作為MRS超早期診斷腦梗死的標準。在本研究中，給藥后VD模型組與假手術(shù)組相比mI增高了，說明神經(jīng)組織自身恢復(fù)時有神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，NBP中劑量組和高劑量組與給藥后VD模型組相比，mI明顯增高，說明足量的NBP可以明顯促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生。

綜上所述，NBP可以對血管性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力起到改善作用，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元代謝產(chǎn)物，以達到改善VD的作用。

[1] Baslow ZM.Evidence that the tri-cellular metabolism of N-acetylaspartate functions as the brain’s operating system:how NAA metabolism supports meaningful intercellular frequency-encoded communications[J].Amino Acids,2010,39(5):1139-1145.

[2] Pendlebury ST,Rothwell M.Prevalence,incidence,and factors associated with pre-stroke and post-stroke dementia:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Neurol,2009,8(11):1006-1018.

[3] Condon B.Magnetic resonance imaging and spectroscopy:how useful is it for prediction and prognosis?[J].EPMA J,2011,2(4):403-410.

[4] Liu YY,Cai ZL,Xue SR,et al.Proxies of cognitive reserve and their effects on neuropsychological performance in patients with mild cognitive impairment[J].J Clin Neurosci,2013,20(4):548-553.

[5] Benfenati F.Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory[J].Acta Biomed,2007,78 (Suppl 1):58-66.

[6] Roman GC.The epidemiology of vascular dementia[A]//.In:Hartmann A,Kuschinsky W,Hoyer S,eds.Cerebral ischemia and dementia.Berlin,Germany:Springer-Verlag,1991,9-15.

[7] Lee MR,Denic A,Hinton DJ,et al.Preclinical (1)H-MRS neurochemical profiling in neurological and psychiatric disorders [J].Bioanalysis,2012,4(14):17871-17804.

[8] Demougeot C,Marie C,Giroud M,et al.N-acetylaspartate:a literature review of animal research on brabrain ischaemia[J].J Neurochem,2004,90(4):776-783.

[9] Koen JD,Yonelinas A.From humans to rats and back again:bridging the divide between human and animal studies of recognition memory with receiver operating characteristics[J].Learn Mem,2011,18(8):5195-5122.

[10] Shang HB,Zhao WG,Zhang WF.Preoperative assessment using multimodal functional magnetic resonance imaging techniques in patients with brain gliomas[J].Turk Neurosurg,2012,22(5):558-565.

[11] Wu TC,Grotta JC.Hypothermia for acute ischaemic stroke[J].Lancet Neurol,2013,12(3):275-284.

[12] Moriguchi T,Harauma A,Salem N.Plasticity of Mouse Brain Docosahexaenoic Acid:Modulation by Diet and Age[J].Lipids,2013,48(4):343-355.

[13] Lei HX,Berthet C,Hirt L,et al.Evolution of the neurochemical profile after transient focal cerebral ischemia in the mouse brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(4):811-819.

[14] Kang BT,Jang DP,Jung DI,et al.Detection of cerebral metabolites in a canine model of ischemic stroke using 1H magnetic resonance spectroscopy[J].Res Vet Sci,2009,87(2):300-306.

[15] Schimanski LA,Lipa P,Barnes CA.Tracking the course of hippocampal representations during learning:when is the map required?[J].J Neurosci,2013,33(7):3094-3106.

(編校：王冬梅)

Effect of butylphthalide on memory function and hippocampal neuronal metabolites in vascular dementia rats

SUN Xiao-ming1,BAO Jun-jie1,ZHANG Hua1, ZHAO He-qing2ZHANG Cai-yuan3,ZHU Li-ping4

(1.Department of Pharmacy, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 2.Department of Internal Medicine-Neurology, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 3.MRI Room, The Second Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China; 4.Department of Basic Medicine, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, China)

ObjectiveTo explore the hippocampal metabolic changes of butylphthalide intervened vasculardementia (VD) rats and the functions of butylphthalide on learning and memory improvement.Methods10 rats were randomly selected from 90 healthy male SD rats to be sham operation group,and the remaining 80 rats were given 2VO surgery to make VD models.48 rats survived after 8 weeks, and then randomly divided into 4 groups: VD model group,NBP low,medium,high dose group,each had 12 rats.Rats of NBP low,medium,high dose group were injected NBP 12.5,25,50 mg /(kg·d), respectively.VD model group and sham operation group were injected with the same volume of 0.5% Tween-80 solution, all rats were continuous injection of 4 weeks.Behavior test was investigated by place navigation test and spatial probe test.Changes of neuronal metabolites were detected by1H-MRS.ResultsBehavior test results indicated that rats’ learning and memory ability were proportional to the DBP dose: 1～5 days, the average escape latency in NBP medium, high dose group were significantly lower than model group (P<0.05),and spatial probe test results indicated that DBP high dose group could significantly improve the learning ability of rats;1H-MRS detection results showed that compared with after administration of VD with those in the model group, NAA/Cr, Cho/Cr and mI/Cr in medium dose group and high dose group, the differences were statistical significance (P<0.05),but no statistical significance in NBP low dose group.The results indicated that the middle dose group and high dose group of glial cells in hippocampus hyperplasia had obvious effect, and low dose NBP group had no obvious effect. ConclusionButylphthalide can improve the ability of learning and memory in rats with vascular dementia, and regulate hippocampal neuronal metabolites to improve function of VD.

butylphthalide;vascular dementia;water maze;hippocampal neuronal metabolites

2009博士點基金(20090142120015)

孫曉鳴，女，本科，主管藥師，研究方向：藥劑科藥品研究，E-mail:qch18214600108@163.com。

R74

A

1005-1678(2015)02-0084-04