富硒化對(duì)博落回有效成分抑菌效果的影響研究

王珂佳，劉蕓，任艷玲Δ

(1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

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富硒化對(duì)博落回有效成分抑菌效果的影響研究

王珂佳1，劉蕓2，任艷玲1Δ

(1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

目的 研究富硒化對(duì)博落回姚效成分抑菌效果的影響。方法 以青霉素鈉、生理鹽水為對(duì)照，采用瓊脂擴(kuò)散紙片法檢測(cè)各富硒化博落回組處理9種常見細(xì)菌的平均抑菌圈直徑；以20%甲醇、生理鹽水作為對(duì)照，用20%的甲醇將平均抑菌圈最小的富硒化博落回組，無硒處理博落回組和青霉素鈉組分別稀釋，使?jié)舛染鶠?.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL，采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定其MIC，評(píng)價(jià)對(duì)其9種常見細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果 富硒化處理能大幅提高博落回生物堿的抑菌效果，100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈最小(15.33 mm)；富硒化博落回生物堿對(duì)大腸桿菌O1、大腸桿菌P22、都伯林大腸桿菌的最低抑菌濃度為從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；對(duì)鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌的最低抑菌濃度為0.12 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL；對(duì)枯草芽孢桿菌和李氏桿菌的最低抑菌濃度小于0.03 mg/mL。結(jié)論 富硒化顯著改善博落回的抑菌效果，為今后富硒博落回的開發(fā)利用，奠定了理論基礎(chǔ)。

富硒化；博落回；血根堿；抑菌效果

博落回MacleayaCordata(wild) R.Br.為罌粟科博落回屬多年生草本植物，別名三錢三，又名筒桿、滾地龍等，在貴州又稱馬耳桿，黃薄荷[1]。博落回中主要含有血根堿(sanguinarine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)、黃連堿(coptisine)、小檗堿(berberine)、博落回堿(boccon-line)、α-別隱品堿(α-allocryptopine)、β-別隱品堿(β-allocryptopine)等異喹啉衍生物類生物堿[2]，其在抗菌消炎、清熱解毒、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等方面具有顯著作用[3]。趙東亮等[4]研究證明鹽酸血根堿具有很強(qiáng)的廣譜抑菌作用。王朝元等[5]研究發(fā)現(xiàn)博落回總生物堿抗菌作用較強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用尤為顯著。此外，楊軍等[6]藥理研究表明，博落回對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷有顯著療效。硒元素為人體必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)的重要成分，硒元素在消除體內(nèi)多種有害自由基,增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗細(xì)胞衰老，抗氧化，抗癌等方面都有突出的作用，硒缺乏會(huì)導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病等地方性疾病[7-8]。目前，隨著對(duì)硒元素生理作用研究的不斷深入，證明了硒元素與人體健康關(guān)系密切。我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，在補(bǔ)硒方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過富硒處理的中草藥，治病同時(shí)可以補(bǔ)硒，且無機(jī)硒經(jīng)中藥植株吸收轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒后，可以降低毒性，提高血硒含量[9]。本文選擇抗菌效果作為考察指標(biāo)[4-5]，比較富硒化博落回提取液和無硒處理博落回提取液對(duì)9種常見細(xì)菌的抑制效果，研究富硒化對(duì)博落回有效成分抑菌效果的影響，為富硒博落回的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 供試菌種共9種，由貴州大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。分別為大腸桿菌P22(EscherichiacoliP22，E.coliP22)，豬霍亂桿菌(Baclilluscholeraesuis,B.choleraesuis)，豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)，大腸桿菌O1(EscherichiacoliO1，E.coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)，李氏桿菌(Listeriamurrayi，L.murrayi)，鼠傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)，都伯林大腸桿菌(EscherichiaDublin，E.Dublin)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)。

1.2 藥品與試劑 博落回采自產(chǎn)地貴州省施秉縣，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅應(yīng)春副教授鑒定為罌粟科植物博落回MadeayaCordate(Wild)R.Br。牛肉膏(購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；蛋白胨(購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；瓊脂粉(購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；注射用青霉素鈉(800萬單位，購自華北制藥有限公司)。氯化鈉(購自天津市大茂試劑廠)；鹽酸，氫氧化鈉(購自重慶川江試劑廠)；亞硒酸鈉(購自成都市科龍?jiān)噭S)。

1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：用于細(xì)菌培養(yǎng)。主要成分蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉8 g，蒸餾水1000 mL， pH 7.0～7.5。

1.4 方法

1.4.1 博落回富硒化處理：采用分根繁殖手段移栽15株博落回植株，設(shè)置0、60、80、100、120 μg/mL Na2SeO35個(gè)實(shí)驗(yàn)組[10-11]，每組均含3株博落回植株。待幼苗成活并長(zhǎng)至20 cm時(shí)，分別用對(duì)應(yīng)濃度的亞硒酸鈉溶液進(jìn)行葉面噴施，每月1次，共3次。待博落回果實(shí)成熟后，采樣曬干，粉碎成細(xì)粉過60目篩備用。

1.4.2 藥物制備：按王珂佳等[12]方法提取富硒化處理各組博落回生物堿，提取液用20 %甲醇定容，使提取液中血根堿濃度為0.5 g/mL。冷藏備用。

1.4.3 藥品配制：將經(jīng)富硒化博落回生物堿提取液(血根堿濃度0.5 g/mL)，用20%甲醇配制成血根堿含量分別為0.96 mg/mL和4.8 mg/mL的溶液，備用。

1.4.4 菌懸液的制備：用接種環(huán)在斜面上先劃一條直線，再蘸取已活化菌種在斜面上劃Z字性斜線，避免菌種間污染，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，觀察培養(yǎng)情況并選取生長(zhǎng)情況良好的菌種，用含0.1 %吐溫80生理鹽水將菌種洗出，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度至105～106個(gè)/mL。

1.4.5 抑菌試驗(yàn)：① 定性試驗(yàn)：采用瓊脂擴(kuò)散紙片法[4]進(jìn)行富硒化博落回生物堿抑菌效果定性試驗(yàn)。用含0.1 %吐溫80生理鹽水將菌種洗出，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，用移液槍(槍頭需經(jīng)高壓滅菌)吸取50 μL菌液放入盛有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒均勻涂抹，倒置10 min。再用移液槍分別吸取血根堿含量為0.96 mg/mL的各富硒化處理組藥品10 μL，添加到直徑為7 mm濾紙片(已高壓滅菌)上，把濾紙片放入培養(yǎng)皿中，以青霉素鈉、生理鹽水為對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)皿放同種藥品各個(gè)待測(cè)物濾紙片各1片，重復(fù)3次，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，觀察測(cè)量，取平均值。

② 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測(cè)定：采用瓊脂平板稀釋法[4]測(cè)定富硒化博落回生物堿的MIC。用20 %的甲醇將定性試驗(yàn)中平均抑菌圈最小的一組富硒化博落回生物堿提取液，無硒處理博落回生物堿和青霉素鈉分別稀釋，富硒化博落回生物堿、無硒處理博落回生物堿的濃度分別為0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL；青霉素鈉濃度分別為0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL。以20 %甲醇、生理鹽水作為對(duì)照。將所培養(yǎng)的9種菌種稀釋至1×105個(gè)/mL, 用多點(diǎn)接種器蘸取制備好菌液(約1～2 μL)接種于上述制備的平板培養(yǎng)基表面，每點(diǎn)菌數(shù)約100～200個(gè)，形成直徑為8～10 mm的菌斑，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)操作3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 富硒化博落回生物堿對(duì)不同菌種的抑菌效果 經(jīng)富硒化處理博落回生物堿比對(duì)照組的抑菌效果有大幅度提高，且博落回生物堿抑菌效果，隨植株中硒元素含量增加而提高。100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最小。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 富硒化博落回生物堿的抑菌效果實(shí)物圖1.0 μg/mL亞硒酸鈉處理組；2.60 μg/mL亞硒酸鈉處理組；3.80 μg/mL亞硒酸鈉處理組；4.100 μg/mL亞硒酸鈉處理組；5.120 μg/mL亞硒酸鈉處理組；6.青霉素鈉；7.生理鹽水Fig.1 Inhibitory effect of se-Madeaya Cordate(Wild)R.Br alkaloids physical map1.0 μg/mL sodium selenite treatment group;2.60 μg/mL sodium selenite treatment group; 3.80 μg/mL sodium selenite treatment group;4.100 μg/mL sodium selenite treatment group; 5.120 μg/mL sodium selenite treatment group;6.penicillin sodium;7.saline

組別實(shí)驗(yàn)菌種E.coliP22B.choleraesuisS.suisE.coliO1S.aureusL.murrayiS.typhimuriumE.DublinB.subtilis平均值青霉素鈉組0272940273.67生理鹽水組0120111000.67亞硒酸鈉處理組0μg/mL71211717151251511.2260μg/mL13171212192017122115.8880μg/mL14191312201819142316.89100μg/mL12171310181718122115.33120μg/mL16181311212018112116.56

0 μg/mL的亞硒酸處理組為空白對(duì)照，青霉素鈉為陽性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照

2.2 富硒化博落回生物堿的最低抑菌濃度 在2.1項(xiàng)下的各實(shí)驗(yàn)組中，與其他處理組相比，100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈最小，故選取該組測(cè)定富硒化博落回生物堿最低抑菌濃度，見表2。

表2 富硒化博落回生物堿對(duì)種細(xì)菌的最低抑菌濃度,n=3)

CK1：生理鹽水對(duì)照；CK2：20 %甲醇對(duì)照。“—”為無菌生長(zhǎng)，“+”為少量菌生長(zhǎng)，“+++”為大量菌生長(zhǎng)

由表2可知，經(jīng)富硒化處理博落回生物堿對(duì)以上細(xì)菌的最低抑菌濃度都有一定降低。其中，對(duì)E.coliO1、E.coliP22、E.Dublin的最低抑菌濃度為從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL； 對(duì)S.typhimurium、B.choleraesuis的最低抑菌濃度為0.12 mg/mL；對(duì)S.aureus、S.suis的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL；對(duì)B.subtilis和L.murrayi的最低抑菌濃度小于0.03 mg/mL，效果較好。

3 討論

研究證明，作為中藥材資源豐富的貴州省，其土壤全硒含量范圍為0.064～1.326 mg/kg，平均值為0.369 mg/kg，高于世界(0.200 mg/kg)和全國(guó)(0.290 mg/kg)土壤平均硒含量[13]。貴州省內(nèi)土壤局部達(dá)到富硒水平，適宜發(fā)展富硒中藥材產(chǎn)業(yè)。同時(shí)，中藥博落回在貴州有廣泛分布，其生物堿具有一定的抑菌作用，除大腸桿菌以外，對(duì)于其他桿菌、球菌，革蘭氏陰性和陽性菌均有極強(qiáng)的抑菌效果[1-2]。為了進(jìn)一步改善博落回總生物堿的抗菌效果，提高其抗菌譜，本研究以硒元素作為添加劑，研究了富硒化處理博落回的抑菌效果。研究結(jié)果表明：與青霉素鈉比對(duì)，富硒化處理的博落回生物堿對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌等9種細(xì)菌的抑菌效果得到顯著增強(qiáng)，且其抑菌效果在一定范圍內(nèi)與亞硒酸鈉濃度成正相關(guān)，亞硒酸鈉濃度為100 mg/mL時(shí)其平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最??；富硒化博落回生物堿的最低抑菌濃度均都有大幅的降低，尤其是大腸桿菌的最低抑菌濃度，從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；降幅顯著。綜上所述，富硒化有利于改善博落回的抑菌效果，為今后富硒博落回的開發(fā)利用，奠定了理論基礎(chǔ)。

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(編校：王冬梅)

Study on the antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata

WANG Ke-jia1, LIU Yun2, REN Yan-ling1Δ

(1.Guizhou Light Industry Technical College, Guiyang 550002, China; 2.Tongren Polytechnic College, Tongren 554300, China)

ObjectiveTo study on antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata.MethodsPenicillin sodium and saline as control, detected the average inhibition zone diameter of se-enriched Macleya cordata group (containing 0.96 mg/mL sanguinarine) on 9 common bacteria with disc agar diffusion method;20% methanol and saline as control, se-enriched Macleya cordata group which the average inhibition zone diameter was minimum, without se-enriched Macleya cordata group and penicillin sodium were diluted with 20% methanol, made concentration of 0.48,0.24,0.12,0.06, 0.03 mg/mL. minimal inhibitory concentration (MIC) of each treatment group was determined by agar dilution method, evaluated antibacterial effect of se-enriched Macleaya cordata group. Resultsse-enriched Macleya cordata group could improve antibacterial effect significantly, the average inhibition zone of 100 μg/mL sodium selenite treatment group was minimum(Φ15.33 mm);MIC of se-enriched Macleya cordata group onE.coliO1,E.coliP22,E.Dublinreduced from 0.96 to 0.24 mg/mL; MIC ofS.typhimuriumandS.suiparewere 0.12 mg/mL; MIC ofS.aureusandS.suiswere 0.06 mg/mL; MIC ofE.DublinandL.murrayiwere less than 0.03 mg/mL. ConclusionSe-enriched Macleya cordata improves the antibacterial effect signififcantly, and it lays the theoretical foundation for development and utilization of se-enriched Macleya cordata for future.

selenium-enriched;Macleya cordata; sanguinarine;antibacterial effect

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2013]2149號(hào))

王珂佳，男，碩士，講師，教務(wù)處副處長(zhǎng)，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：200811938@qq.com；任艷玲，通訊作者，女，博士，講師，研究方向：植物病蟲害及其防治和生態(tài)學(xué)，E-mail：43182481@qq.com。

R931.6

A

1005-1678(2015)05-0010-04