白芍總苷通過下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路改善阿霉素腎病大鼠腎纖維化

朱亞利，關(guān)鳳軍，安娜，白沙沙，楊珊珊

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 徐州 221002)

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白芍總苷通過下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路改善阿霉素腎病大鼠腎纖維化

朱亞利，關(guān)鳳軍，安娜，白沙沙，楊珊珊

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 徐州 221002)

目的 探討白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織纖維化的影響及其機(jī)制。方法 30只健康雄性SD大鼠尾靜脈注射阿霉素制備模型，成模后隨機(jī)分為模型對(duì)照組(ADRN組)和白芍總苷干預(yù)組(TGP組)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(CON組)；干預(yù)8周后ELISA法檢測(cè)血清Cr、BUN；尿蛋白定量法測(cè)24 h尿蛋白；Masson染色觀察腎臟纖維化程度；RT-PCR法檢測(cè)腎組織TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)腎組織TLR4/NF-κB/TGF-β1蛋白含量。結(jié)果 與CON組相比，ADRN組大鼠血清Cr、BUN、24 h尿蛋白水平升高(P<0.01)，腎組織纖維化程度加重(P<0.01)，TLR4/NF-κB/TGF-β1表達(dá)升高(P<0.05)；與ADRN相比，TGP組大鼠Cr、BUN、24 h尿蛋白水平下降(P<0.01)，腎組織纖維化程度減輕(P<0.01)，TLR4/NF-κB/TGF-β1表達(dá)下降(P<0.05)。結(jié)論 TGP可以改善阿霉素腎病大鼠的腎臟功能，減輕病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1通路進(jìn)而改善阿霉素大鼠腎纖維化有關(guān)。

白芍總苷；TLR4/NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路；阿霉素大鼠；腎纖維化

原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)為兒童常見的腎臟疾病，其中微小病變腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化分別占兒童原發(fā)性腎病綜合征的80%～90%與5%～10%[1-2]。目前，阿霉素腎病(adriamycin-induced nephropathy，ADRN)模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的能較好模擬人類微小病變及局灶節(jié)段性腎小球綜合征的動(dòng)物模型，其臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，低蛋白血癥，高脂血癥等[3-4]，除此之外，阿霉素腎病大鼠腎小球及腎小管內(nèi)有纖維蛋白原的出現(xiàn)，并隨時(shí)間的變化而持續(xù)增加，可出現(xiàn)腎臟纖維化[5-6]。

近幾年改善腎組織纖維化的輔助治療的研究多集中在中藥領(lǐng)域，其中白芍總苷的相關(guān)研究較為廣泛，白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)是白芍干燥根的提取物，主要成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等[7]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGP可治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系膜型腎炎及免疫性肝損傷。然而TGP對(duì)阿霉素腎病大鼠腎纖維化的影響鮮見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎纖維化模型，觀察TGP對(duì)阿霉素腎病大鼠腎纖維化的影響，并探討其減輕纖維化的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 健康SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK(蘇)2010-0011] 提供；阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：130702)；白芍總苷(寧波立華制藥有限公司，批號(hào)：150107)；尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150113)；大鼠肌酐、尿素氮Elisa試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：201503)；Masson三色染色液(上海源葉生物科技有限公司)；TLR4、NF-κB、TGF-β1及β-actin引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；超敏兔兩步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋，批號(hào)：K153317B)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋，批號(hào)：K1553317E)；兔抗TLR4多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：217847)；兔抗NF-κB多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：ZP1310BP10)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(Abcom，批號(hào)：GR148954-1)；BX43F型正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Carestream公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON組，8只)和造模組(22只)，造模組[8]按4 mg/kg尾靜脈注射阿霉素濃度為2 mg/mL，注射體積為0.32～0.40mL，間隔一周后，再次尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。飼養(yǎng)8周后，收集24 h尿液，以24 h尿蛋白含量大于100 mg為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，阿霉素腎病大鼠成模16只，分為阿霉素腎病模型組(ADRN組，8只)及白芍總苷組(TGP組，8只)。白芍總苷組給予TGP 100 mg/kg灌胃，濃度為10 mg/mL,給藥體積為1.9～2.5 mL。每天1次，CON組及ADRN組給予等體積生理鹽水灌胃，共8周。8周后每組老鼠均剩余6只，收集尿液、血、腎組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 腎功能生化指標(biāo)檢測(cè)：尿蛋白定量試劑盒檢測(cè)24 h尿蛋白含量，大鼠肌酐、尿素氮Elisa試劑盒檢測(cè)Cr、BUN含量，操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 腎組織Masson染色：取腎組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，連續(xù)切片(厚4 μm)，每5張取1張，每個(gè)標(biāo)本取3張切片。脫蠟后行Masson染色，光鏡下觀察細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測(cè)量膠原纖維陽(yáng)性區(qū)占所觀察視野的面積比。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)腎組織TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表達(dá) 于-80 ℃ 冰箱取出腎組織，按Trizol試劑說(shuō)明書方法提取腎組織總RNA。取1 μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所用 RT-PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下：TGF-β1正向引物序列為：5’- ATGTGCAGGATAATTGCTGCC -3’， 反向引物序列為：5’-TGGTGTTGTACAGGCTGAGG-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度為182bp。 NF-κB正向引物序列為：5′-TGCGAATGGAGCGACAGG-3′，反向引物序列為：5′-AGGCCAAATGAAAGGAGTGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為243bp。TLR4正向引物序列為：5’- CCAGAGCCGTTGGTGTAT-3’，反向引物序列為：5’-GCCCTGTGAGGTCGTTGA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為419bp。β-actin正向引物序列為：5’-TCAGGTCATCACTATC-GGCAAT-3’，反向引物序列為：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAA-CGCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為432bp。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)對(duì)每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描，用TLR4、NF-κB及TGF-β1的灰度值與β-actin的比值表示目的基因TLR4、NF-κB及TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)腎組織TLR4/NF-κB/TGF-β1蛋白含量：取腎組織常規(guī)石蠟包塊制作切片，連續(xù)切片(厚4 μm)，每5張取1張，每個(gè)標(biāo)本取3張切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TLR4、NF-κB及TGF-β1蛋白含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行?？贵w按1:200的方法稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，將切片置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，陽(yáng)性區(qū)出現(xiàn)棕黃色顆粒，用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測(cè)量TLR4、NF-κB及TGF-β1蛋白的平均積分吸光度。

2 結(jié)果

2.1 腎功能指標(biāo) 與CON組相比，ADRN組大鼠的Cr、BUN、24 h尿蛋白升高(均P<0.01)，提示阿霉素腎病造模成功。與ADRN組相比，TGP組的Cr、BUN、24h 尿蛋白有所下降(均P<0.01)，表明TGP可改善阿霉素腎病大鼠的腎臟功能，見表2。

表2 TGP對(duì)阿霉素大鼠腎功能生化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of TGP on renal function of adriamycin-induced nephropathy ±s, n=6)

**P<0.01，與CON組比較，compared with CON group；##P<0.01，與ADRN組比較， compared with ADRN group

2.2 腎組織Masson染色 各組腎臟組織Masson染色，見圖1。CON組大鼠腎組織可見少許膠原纖維沉積。ADRN組大鼠的膠原纖維沉積更加明顯。TGP組膠原沉積有所減輕。用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測(cè)量膠原纖維陽(yáng)性區(qū)占所觀察視野的面積比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原纖維陽(yáng)性區(qū)占所觀察視野的面積比依次為CON組：0.008±0.001，ARDN組：0.11±0.02，TGP組：0.04±0.02。與CON組相比，ADRN組大鼠腎臟組織膠原纖維顯著增多(P<0.01)；與ADRN比，TGP組大鼠膠原纖維顯著減少(P<0.01)。

圖1 TGP對(duì)阿霉素腎病大鼠腎纖維化的作用(×200，n=6)**P<0.01，與CON組比較；## P<0.01，與ADRN組比較Fig.1 Effects of TGP on renal fibrosis in adriamycin-induced nephropathy rats (×200，n=6)**P<0.01， compared with CON group；## P<0.01，與ADRN組比較， compared with ADRN group

2.3 腎臟RT-PCR結(jié)果 各組TLR4 mRNA的相對(duì)灰度值分別為CON組：0.06±0.01，ARDN組：0.21±0.01，TGP組：0.17±0.03；各組NF-κB mRNA的相對(duì)灰度值分別為CON組：0.08±0.03，ARDN組：0.28±0.02，TGP組：0.15±0.02；各組TGF-β1mRNA的相對(duì)灰度值分別為CON組：0.07±0.03，ARDN組：0.40±0.03，TGP組：0.16±0.01。與CON組相比，ADRN組大鼠腎組織TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與ADRN相比較，TGP組大鼠腎組織TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明TGP有抑制TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表達(dá)的作用，見圖2。

圖2 TGP對(duì)阿霉素腎病大鼠TLR4/NF-κB/TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響(n=6)**P<0.01，與CON組比較；#P<0.05,## P<0.01，與ADRN組比較Fig.2 Effects of TGP on expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1 mRNA in adriamycin-induced nephropathy rats(n=6)**P<0.01， compared with CON group；#P<0.05，## P<0.01， compared with ADRN group

2.4 腎臟免疫組化結(jié)果 CON組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TGF-β1低表達(dá)，陽(yáng)性顆粒散在，染色較淺；ADRN組高表達(dá)，棕黃色信號(hào)強(qiáng)，融合成片，而TGP組表達(dá)顯著降低，如圖3，用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)分別測(cè)量每張切片的平均積分吸光度，各組TLR4蛋白的平均積分吸光度依次為CON組：0.07±0.01，ADRN組：0.17±0.04，TGP組：0.09±0.02；各組NF-κB蛋白的平均積分吸光度依次為CON組：0.06±0.02，ADRN組：0.37±0.03，TGP組：0.11±0.01；各組TGF-β1蛋白的平均積分吸光度依次為CON組：0.10±0.02，ADRN組：0.40±0.04，TGP組：0.23±0.02。與CON組相比，TLR4、NF-κB、TGF-β1的表達(dá)在ADRN組中明顯升高(P<0.05)；與ADRN組相比，TGP組的TLR4、NF-κB、TGF-β1表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖3 TGP對(duì)阿霉素腎病大鼠TLR4/NF-κB/TGF-β1 蛋白表達(dá)的影響(n=6)*P<0.05,**P<0.01，與CON組比較；#P<0.05,##P<0.01，與ADRN組比較Fig. 3 Effects of TGP on expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1 of adriamycin-induced nephropathy rats(n=6)*P<0.05,**P<0.01， compared with CON group；#P<0.05,##P<0.01， compared with ADRN group

3 討論

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類I型跨膜糖蛋白模式識(shí)別受體，可識(shí)別多種細(xì)胞內(nèi)外病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，活化的TLRs可激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)促炎性因子表達(dá)，參與固有免疫等[9-12]。其中，TLR4可與配體纖維蛋白原結(jié)合后活化，并通過髓分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴及MyD88非依賴的信號(hào)通路來(lái)激活核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)，NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，其活化后發(fā)生核轉(zhuǎn)位[13]，由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核[6]，參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)的合成[14]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，通過自分泌和旁分泌來(lái)發(fā)揮其多功能的調(diào)節(jié)作用，具有促進(jìn)腎組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)聚集的作用[15-16]。它除了可上調(diào)膠原蛋白mRNA的表達(dá)，促使膠原組織合成增加外，還能通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)以及促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的合成來(lái)減少ECM的降解，進(jìn)而介導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生[17-18]。

研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷抗肝纖維化的主要機(jī)制之一，可能是通過抑制纖維化大鼠肝組織NF-κB和TGF-β1的表達(dá)而發(fā)揮作用[19]。本研究基于白芍總苷廣泛的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用，探討其改善腎組織纖維化的相關(guān)機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，Masson染色示阿霉素腎病大鼠出現(xiàn)腎纖維化，腎臟組織中TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示阿霉素腎病大鼠腎纖維化的發(fā)生可能是TLR4/NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路的過度活化；白芍總苷干預(yù)組的腎纖維化有所改善，并且TLR4/NF-κB/TGF-β1通路的表達(dá)下調(diào)，提示白芍總苷可通過下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1通路改善阿霉素大鼠腎纖維化，下一步本課題組將在細(xì)胞水平運(yùn)用基因敲除技術(shù)對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)探討。

綜上所述，TGP可以改善阿霉素大鼠的腎臟功能，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1通路進(jìn)而改善阿霉素大鼠腎纖維化有關(guān)。

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(編校：譚玲)

Total glucosides of paeony inhibits adriamycin-induced nephropathy in rats through blocking TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling

ZHU Ya-li, GUAN Feng-jun, AN Na, BAI Sha-sha, YANG Shan-shan

(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo study effect and its possible mechanism of total glucosides of paeony (TGP) on adriamycin-induced nephropathy rats.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into normal group (CON), adriamycin-induced nephropathy group (ADRN) and TGP-treated ADRN group (TGP).The rat nephropathy model was established by adriamycin injection.At the end of the 8thweek after treatment, ELISA was used to detect the level of Cr and BUN.The values of 24 urine protein was determined by urinary protein kit.Masson staining was used to observe the fibrosis.RT-PCR was used to detect the mRNA levels of TLR4/NF-κB/TGF-β1.Immunohistochemical method was used to detect the content of TLR4/NF-κB/TGF-β1.ResultsCompared with the CON group, the level of Cr, BUN, 24 urine protein of ADRN group rised(P<0.01), the degree of fibrosis of ADRN group were aggravated(P<0.01), and the expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1of ADRN group increased significantly.However, compared with ADRN group, the(P<0.01) level of Cr, BUN, 24 urine protein of TGP-treated rats reduced(P<0.01), the degree of fibrosis of TGP-treated rats eased(P<0.05), and the expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1of TGP-treated rats decreased significantly.ConclusionTGP retards the process of fibrosis and reduces the pathological damage in adriamycin-induced rats by down-regulating the expression of TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling.

total glucosides of paeony; TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling; adriamycin-induced nephropathy rats; fibrosis

朱亞利，女，碩士，研究方向：兒科腎臟方向，E-mail：zhuyali0105@126.com；關(guān)鳳軍，通訊作者，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：兒科腎臟方向，E-mail：guanxiaomu@sina.com。

R692

A

1005-1678(2015)07-0043-04