神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

張波，戚利坤，李立新

(1.青海省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007；2.青海省第五人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

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神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

張波1Δ，戚利坤2，李立新3

(1.青海省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007；2.青海省第五人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

目的 探究單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialoganglioside，GM1)對大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法 采用落體撞擊法使大鼠左頂葉形成局部性腦挫裂傷。將65只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=5)、腦損傷組(n=30)和GM1組(n=30)，分別在造模給藥后3、7、14、28、56、168 h時(shí)，每次各組隨機(jī)選取5只(假手術(shù)組為1只)，通過免疫組化染色檢測腦組織Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)以及PARP降解情況，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果 腦損傷組各時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GM1組各時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)與腦損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且GM1組在14 h后Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥后Bax/Bcl-2比值有所下降，在14 h下降最為明顯。腦損傷組PARP降解及細(xì)胞凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，GM1組PARP降解在28、56、168 h顯著低于腦損傷組(P<0.05)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)顯著低于腦損傷組(P<0.05)。結(jié)論 神經(jīng)節(jié)苷脂GM1能夠降低急性腦損傷大鼠Bax/Bcl-2比值，同時(shí)PARP降解緩解，凋亡細(xì)胞減少。

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂;急性腦損傷;細(xì)胞凋亡

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialoganglioside，GM1)主要分布于腦內(nèi)，GM1是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不可缺少的因子，且對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著保護(hù)作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)[1]，缺血再灌注形成腦損傷時(shí)，腦組織內(nèi)源性GM1含量下降，是腦損傷后神經(jīng)元損傷、功能損害的重要原因。內(nèi)源性GM1可能是通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bal-2、Bax的含量控制細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護(hù)腦損傷的作用[2-3]。目前研究證實(shí)，外源性GM1能夠通過血腦屏障，對神經(jīng)元的凋亡起著一定的抑制作用,同時(shí)促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)元的修復(fù)[4]，但是對于GM1在急性腦損傷中修復(fù)的作用和機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠急性腦損傷模型，探究外源性GM1對大鼠急性腦損傷修復(fù)的影響以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：65只雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部，動物許可證號：SCXK(湘)2010-0004，體質(zhì)量250～300 g，2月齡，給予正常飼料喂養(yǎng)。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.1.2 試劑與儀器：Bax、Bcl-2單克隆抗體購自Cell Signaling公司；TUNEL試劑盒購自羅氏(Roche)公司；Anti-PARP p85 Fragment pAb試劑盒購自Promega公司。HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)購自武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司；OCT冰凍切片包埋劑購自上?；鶆ι锟萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及急性腦損傷大鼠模型的建立：SD大鼠65只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=5)、腦損傷組(n=30)、GM1組(n=30)(腦損傷10 min后腹腔注射GM1，50mg/kg)。

腦損傷的模型建立采用Feeney等[5]的落體沖撞法以致左頂葉局部性腦挫裂傷，形成挫傷沖擊力大小為500g/cm。2組大鼠分別于造模后3、7、14、28、56、168 h時(shí)，每次各隨機(jī)選取5只(假手術(shù)組為1只)處死，將假手術(shù)組大鼠各時(shí)點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況合并統(tǒng)計(jì)，處死后均取損傷左頂葉與對側(cè)腦組織，用4%的多聚甲醛固定后，OCT冰凍切片包埋劑包埋，常規(guī)切片5～6μm，用于免疫組化檢測。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物模型評價(jià)系統(tǒng)：評價(jià)急性腦損傷模型采用Feeney等[5]評定方法，共4級：0級，神經(jīng)功能無損傷；1級，提尾見大鼠癱瘓側(cè)前肢回收彎曲，正常側(cè)往前展開；2級，1級表征外，觸碰大鼠癱瘓側(cè)遇阻力低于正常側(cè)；3級，2級表征外，大鼠爬動時(shí)往癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；模型建立后2 h開展評分，若大鼠評為0級則選入假手術(shù)組。評價(jià)為1、2、3級則模型建立成功，為腦損傷組。

1.2.3 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax蛋白：按Bcl-2、Bax單克隆抗體試劑盒說明書對切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下分別觀察各組不同時(shí)間點(diǎn)的損傷局部與同側(cè)部位。Bax和Bcl-2陽性細(xì)胞的細(xì)胞漿以及核膜判定為棕黃色顆粒狀物質(zhì)。染色結(jié)果利用HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析軟件分析，每例切片各選取5個(gè)視野，測定陽性細(xì)胞灰度值，以及背景灰度值，計(jì)算相對灰度值(相對灰度值=背景灰度值-陽性灰度值)及平均相對灰度值， 相對灰度值越高， 表明蛋白表達(dá)越強(qiáng)。Bax/Bcl-2比值

越大凋亡率越高。

1.2.4 TUNEL染色檢測腦損傷PARP降解：采用Anti-PARP p85 Fragment pAb和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)分別檢測各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)損傷局部與對側(cè)部位的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)降解情況及細(xì)胞凋亡情況，參照試劑盒說明書操作，凡能在細(xì)胞核內(nèi)觀測到棕黃色顆粒的為TUNEL染色陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 模型評價(jià) 建立急性腦損傷模型2 h后進(jìn)行模型評價(jià)，假手術(shù)組大鼠腦損傷評價(jià)6只均為0；腦損傷組1級11只，2級12只，3級7只；GM1組1級12只，2級12只，3級6只。

2.2 免疫組化檢測Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá) Bcl-2與Bax蛋白免疫組化染色結(jié)果見圖1。Bcl-2蛋白的表達(dá)在GM1腹腔注射后14 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后降低，而Bax蛋白的表達(dá)在腹腔注射后28 h達(dá)到最低。腦損傷組各時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GM1組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著與腦損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且GM1組在14 h后Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥后Bax/Bcl-2比值有所下降，在14 h下降最為明顯。見表1。

圖1 免疫組化檢測GM1組中Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)(×200)Fig.1 Expression of Bax and Bcl-2 protein in GM1 group detected by immunohistochemistry(×200)

組別檢測指標(biāo)3h7h14h28h56h168h假手術(shù)組(n=6)BaxBcl-2Bax/Bcl-285.24±2.4189.00±6.800.93腦損傷組(n=5)Bax103.77±6.89*104.53±2.26*106.00±3.19*107.98±4.23*108.32±1.70*119.99±2.33*Bcl-2102.72±5.92*110.77±3.40*120.99±2.86*96.32±4.42*100.55±4.00*95.86±1.70*Bax/Bcl-21.011.071.001.101.071.22GM1組(n=5)Bax92.53±2.41*#93.39±1.11*#94.00±2.44#95.95±4.49#86.23±1.76#85.12±2.58#Bcl-2102.07±3.30*89.11±3.46#88.66±3.42#86.55±3.72#90.66±1.11#87.45±4.22#Bax/Bcl-20.900.850.720.880.940.96

*P<0.05,與假手術(shù)組比較，compared with sham-operation；#P<0.05，與腦損傷組比較，compared with brain injury group

2.3 TUNEL染色與腦急性損傷PARP降解測定 腦損傷組PARP降解及細(xì)胞凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，GM1組PARP降解在28、56、168 h顯著低于腦損傷組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)顯著低于腦損傷組(P<0.05)，其中PARP降解在14 h后開始減緩。見表2。

表2 各組大鼠急性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)PARP降解與細(xì)胞凋亡的變化±s，%)Tab.2 Changes of PARP degradation and neuronal apoptosis at different time points after traumatic brain injury in each ±s，%)

*P<0.05,與假手術(shù)組比較，compared with sham-operation；#P<0.05，與腦損傷組比較，compared with brain injury group

3 討論

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)具有介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，可以調(diào)控細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的功能。Bcl-2和Bax 2者形成了凋亡的正負(fù)控制，其比值決定了細(xì)胞是否出現(xiàn)凋亡。實(shí)驗(yàn)從急性腦損傷大鼠的腦皮質(zhì)免疫組化觀察到損傷的不同時(shí)間下GM1對Bcl-2,Bax蛋白表達(dá)及PARP降解的變化。GM1能夠通過血腦屏障與GM1受體結(jié)合，作用至神經(jīng)元，從而加速蛋白的合成，起到促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，防止損傷的神經(jīng)元凋亡的作用,可能與GM1的量有關(guān)。急性腦損傷中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有GM1含量的下降以及神經(jīng)元的損傷，補(bǔ)充GM1在一定程度上可以抑制損傷造成的細(xì)胞凋亡[6-7]。Bax蛋白有對抗Bcl-2蛋白抑制而細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡必須通過與Bax形成異源二聚體來實(shí)現(xiàn)，2者復(fù)雜的反應(yīng)與調(diào)控，產(chǎn)生細(xì)胞存亡的不同結(jié)果。

本研究免疫組化的結(jié)果顯示，腦損傷組的大鼠Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯下降，而Bax的表達(dá)明顯升高，與很多研究報(bào)道的結(jié)論一致[8-9]，Bcl-2和Bax與腦損傷細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可能是由于線粒體氧代謝的改變，細(xì)胞氧化應(yīng)激等原因[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腹腔注射外源性GM1可以顯著地降低Bax蛋白的含量，增加Bcl-2的含量，可能與外源性GM1通過調(diào)控線粒體通路蛋白含量，抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，腹腔注射GM1后，Bax/Bcl-2的比值在14 h時(shí)達(dá)到最低值，且此時(shí)PARP降解的測定與TUNEL染色均顯示凋亡細(xì)胞的數(shù)目減少，提示GM1腹腔注射14 h后效果最好。因此，外源性GM1不僅對急性腦損傷后神經(jīng)元的凋亡有抑制作用，而且在14 h藥物效果較好。

本研究探究了GM1 在急性腦損傷的作用及相關(guān)機(jī)制，結(jié)果證實(shí)GM1能夠通過Bax，Bcl 2蛋白抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦損傷組織修復(fù)。但外源性GM1調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的含量的具體機(jī)制，以及外源性GM1的藥效學(xué)特征、藥物代謝動力學(xué)特征對其神經(jīng)保護(hù)作用的影響，仍需要進(jìn)一步基礎(chǔ)研究支持，從而為臨床上治療急性腦損傷提供有利的保證。

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(編校：王儼儼)

Protective effect of ganlioside GM1 on rats with acute brain trauma and its relevant mechanism

ZHANG Bo1Δ, QI Li-kun2,LI Li-xin3

(1. Department of Neurology, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, China; 2. Department of Neurology, Fifth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China; 3. Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo explore the protective effect of monosialoganglioside (GM1) on rats with acute brain trauma and its relevant mechanism. MethodsLocalized brain contusion model in rats were constructed by Feeney’s method. 65 SD rats were randomly divided into three groups: sham-operation group (n=5), brain injury group (n=30) and GM1 group (n=30). The rats were killed at 3, 7, 14, 28, 56, 168 h after administration, 5 rats in each group (1 rats in sham-operation group). Bax and Bcl-2 protein expression and PARP were decected by immunohistochemical method. The neuronal apotosis was detected by TUNEL. ResultsThere were significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein between brain injury group and sham-operation group at each time point (P<0.05). There were significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein between GM1 group and brain injury group at each time point (P<0.05), while there were no significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein after 14 h between GM1 group and sham-operation group. After administration, the Bax/Bcl-2 values decreased and was obvious at 14 h. Degradation of PARP and rate of neuronal apotosis in brain injury group at each time point were significantly higher than those in sham-operation group (P<0.05). Degradation of PARP in GM1 group at 28 h, 56 h, 168 h were significant lower than those in brain injury group (P<0.05), and rate of neuronal apotosis was lower at each time point than those in brain injury group (P<0.05). ConclusionGM1 could reduce value of Bax/Bcl-2, degradation of PARP and apoptosis in rats with traumatic injury brain.

monosialoganglioside; acute brain trauma; apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81171147)

張波，通訊作者，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科常見病、多發(fā)病及神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)，E-mail: qch1821460057@163.com。

R96

A

1005-1678(2015)09-0048-03