抗黑色素瘤藥物異甘草素對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)理的研究

龐得全,王英曼,鄭維國(guó),戴云飛

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000)

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抗黑色素瘤藥物異甘草素對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)理的研究

龐得全1,王英曼2,鄭維國(guó)3,戴云飛1

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000)

目的 探討黑色素瘤藥物異甘草素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理。方法 采用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法，研究異甘草素對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用和抑制動(dòng)力學(xué)，研究甘草素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果 異甘草素對(duì)單酚酶和二酚酶都有良好的抑制作用，IC50分別為(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，且異甘草素是一種可逆的競(jìng)爭(zhēng)型酪氨酸酶二酚酶抑制劑，抑制常數(shù)Ki為(12.14±0.54) μM。異甘草素能顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)，酪氨酸酶活性和黑色素含量不斷降低。結(jié)論 異甘草素是良好的酪氨酸酶抑制劑，能抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

異甘草素；酪氨酸酶；黑色素瘤；抑制

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基的含銅氧化還原酶[1]，廣泛存在于動(dòng)植物體，是動(dòng)植物體酶促褐變、體內(nèi)色素合成的關(guān)鍵酶和限速酶[2]；它具有單酚酶的活性，能將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-多巴(鄰位二羥基苯丙氨酸)，也具有二酚酶的活性，能將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌很不穩(wěn)定，可以經(jīng)一系列的非酶促反應(yīng)后，形成黑色素(5,6-二羥吲哚和5,6-二羥吲哚-2-羧酸單元構(gòu)成的異聚體)[3]；但當(dāng)人體酪氨酸酶的活性過(guò)度表達(dá)的，則容易引發(fā)雀斑、黃褐斑、老年斑以及黑色素瘤等。

異甘草素(isoliquiritigenin)屬于異黃酮類(lèi)化合物，大量存在于豆科植物甘草的根、豆芽、鷹嘴豆的幼苗、紅芪、黃芪、滇黃精的根、串果藤、香殊蘭的球莖等[4-8]。異甘草素具有較強(qiáng)的抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等生物活性?？鼓[瘤作用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)探討異甘草素對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理，為其治療皮膚癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375來(lái)自上海中科院細(xì)胞生化所。

1.2 試劑 MTT、Triton X-100 (美國(guó)Amresco公司)；RP-MI 1640培養(yǎng)基 (美國(guó)INVITROGEN 公司)；酪氨酸酶[3610 U/mg，來(lái)源于蘑菇，Sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司]；胎牛血清、異甘草素(分析純)、左旋多巴(L-DOPA，分析純)和L-酪氨酸(L-Tyr,分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；緩沖體系為pH 6.8的磷酸鹽 (50 mmol/L)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國(guó)密理博公司)；培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；pHs-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性的測(cè)定:不同濃度異甘草素(0、50、100、250、200、250、300 μM)分別和酪氨酸酶單酚酶和二酚酶在37 ℃，磷酸鹽緩沖體系中下孵化3 h，分別對(duì)應(yīng)加入L-Tyr和L-DOPA，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件測(cè)定475 nm[9]處吸光值隨時(shí)間的變化，并通過(guò)關(guān)系式：相對(duì)活性(%)=(R/R0)×100%，計(jì)算異甘草素對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制活性；式中R0為無(wú)抑制劑時(shí)吸光度變化的斜率，R為在不同濃度異甘草素的體系中吸光度變化的斜率。曲酸為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.2 異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，固定酪氨酸酶二酚酶的濃度(2 μM)，測(cè)定不同異甘草素濃度(0、 5、10、50、100 μM)條件下，底物濃度對(duì)酶催化速率的影響，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，計(jì)算并評(píng)估異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類(lèi)型，最終求出抑制常數(shù)Ki。

1.4.3 異甘草素對(duì)人惡性黑色素瘤A375的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)[10]：把不同濃度(0、50、100、150、200 μM)的異甘草素和人惡性黑色素瘤A375混合，在37 ℃，5%CO2中孵育48 h，之后加入0.5%的MTT染色液50 μL，繼續(xù)孵育4 h后，2500 r/min，離心30 min，棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO溶液，振蕩器混勻后，測(cè)定570 nm處的吸光值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。在加藥培養(yǎng)48 h的細(xì)胞中，加入磷酸緩沖液和底物L(fēng)-DOPA，于475 nm處測(cè)定黑色素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性；加藥培養(yǎng)48 h的細(xì)胞離心取上清，于475 nm處測(cè)定黑色素瘤細(xì)胞中黑色素生成量。

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用 異甘草素的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 異甘草素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of isoliquiritigenin

隨著異甘草素濃度的增加(0～300 μM)，單酚酶(b)和二酚酶(a)的相對(duì)活性不斷降低，當(dāng)異甘草素濃度達(dá)到100 μM時(shí)，其對(duì)2種酶的抑制能力趨于平緩，解析其對(duì)單酚酶和二酚酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，見(jiàn)圖2。圖3為異甘草素對(duì)酪氨酸酶單酚酶的延滯時(shí)間結(jié)果，結(jié)合圖2可知，隨著異甘草素濃度的增加，單酚酶活力逐級(jí)下降，而遲滯時(shí)間穩(wěn)步上升。

圖2 異甘草素對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase

圖3 異甘草素對(duì)酪氨酸酶單酚酶延滯時(shí)間作用Fig.3 The time delay effect of isoliquiritigenin on monophenolase of tyrosinase

2.2 異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制動(dòng)力學(xué)研究 為進(jìn)一步驗(yàn)證異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類(lèi)型，分析異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制動(dòng)力學(xué)，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作方程，得出異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制作用[11]，并求得抑制常數(shù)Ki為(12.14±0.54) μM，見(jiàn)圖4。

圖4 異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)曲線c(異甘草素)(μM), 從下向上1-5：0, 5, 10, 50, 100 μMFig.4 The inhibition of isoliquiritigenin on diphenolase of tyrosinase with the Lineweaver-Burk plot c(isoliquiritigenin)(μM), from 1 to 5 were 0, 5, 10, 50, 100 μM

2.3 異甘草素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375的影響 隨著異甘草素濃度的不斷增加，A375生長(zhǎng)抑制不斷地增強(qiáng)，A375細(xì)胞中的酪氨酸酶活性和黑色素含量不斷降低，當(dāng)異甘草素的濃度達(dá)到100 μM時(shí)，異甘草素對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖5。酪氨酸酶的抑制效果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，細(xì)胞合成黑色素的能力也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，符合酶催化規(guī)律。

圖5 異甘草素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)抑制作用Fig.5 Effect of isoliquiritigenin on human melanoma A375 cell

3 討論

惡性黑色素瘤是一種具有多發(fā)性、易轉(zhuǎn)移的惡性程度極高的皮膚癌，到目前為止，并無(wú)有效的藥物治療，臨床使用的藥物仍是以化學(xué)合成藥物為主，這些藥物在對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體的正常細(xì)胞產(chǎn)生很大毒性，嚴(yán)重影響人體其他器官的正常生理代謝。因此篩選低毒性的天然活性成分作為抗癌藥物，越來(lái)越受到人們的青睞。本文研究表明，異甘草素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)起到抑制作用，且異甘草素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有濃度依賴(lài)性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)異甘草素能夠使單酚酶穩(wěn)定態(tài)活力逐級(jí)下降，遲滯時(shí)間穩(wěn)步上升，這意味著異甘草素可以逐漸干擾酪氨酸與還原態(tài)酶的結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)手段達(dá)到檢測(cè)限的時(shí)間變長(zhǎng)。

Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖顯示異甘草素對(duì)酪氨酸酶二酸酶是典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這表明異甘草素可能會(huì)結(jié)合到酪氨酸酶的Cu離子活性中心，和底物競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，從而達(dá)到抑制的效果。國(guó)內(nèi)外研究表明[9,12-14]，抑制劑對(duì)疾病有關(guān)的酶的抑制作用在呈現(xiàn)可逆的競(jìng)爭(zhēng)性作用時(shí)，可以根據(jù)酶活性高低，通過(guò)有效控制抑制劑藥物的劑量，來(lái)高選擇性、可逆地降低酶的活性，而不是使酶徹底失活引起其他不良反應(yīng)。在本研究中異甘草素是典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這表明異甘草素可能會(huì)以非共價(jià)力，高選擇性的結(jié)合到酶地活性中心，與底物可逆競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，從而達(dá)到抑制效果。

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(編校：吳茜)

Study on inhibitory mechanism of anti-melanoma drug isoliquiritigenin on tyrosinase

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, ZHENG Wei-guo3, DAI Yun-fei1

(1.Department of Radiotherapy, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, Hebei United University Affiliated Hospital,Tangshan 063000, China; 3.Department of Emergency, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of soliquiritigenin on tyrosinase.MethodsThe inhibition effect and inhibitory kinetics of tyrosinase induced by oliquiritigenin were investigated.The effect of isoliquiritigenin on A375 melanoma cell were preliminarily indicated.ResultsThe inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase was good, IC50was (11.22±0.92) μM and (48.53±4.75) μM, isoliquiritigenin was a competitive inhibitor, the value of inhibition constant (Ki) was (12.14±0.54) μM.Isoliquiritigenin could inhibit the prolifevation of A375 cell significantly, and the tyrosinase activity and melanin synthesis decreased.ConclusionIsoliquiritigenin as a tyrosinase inhibitor, plays an important role in the regulation of melanin, which provides the theoretical basis for the clinical anti skin cancer.

isoliquiritigenin; tyrosinase; melanoma; inhibitory mechanism

河北省科技廳科研項(xiàng)目(112761175)，唐山市科技局指令性計(jì)劃(12140209A-30)

龐得全，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療和綜合治療，E-mail：pangdequandoc@163.com。

R453.9

A

1005-1678(2015)03-0045-03