miR-155、miR-181在急性淋巴細胞白血病患兒外周血單核細胞中的表達及臨床意義

白峰巖 汪海霞 柳 旎 朱彩華 忤秋月

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是兒童常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒童白血病的50%以上[1]。隨著醫(yī)學(xué)的進步，我國ALL患兒5年生存率可達80%左右，但有約15%的患兒出現(xiàn)復(fù)發(fā)，常導(dǎo)致預(yù)后不良的發(fā)生[2]。ALL的主要治療手段以聯(lián)合化療為主，但易發(fā)生骨髓抑制、臟器損傷、黏膜炎癥等不良反應(yīng)[3]。因此，有必要尋找與ALL相關(guān)的分子指標(biāo)對患兒預(yù)后進行監(jiān)測以減少患兒發(fā)生預(yù)后不良的情況。微小RNA(mirco-RNA，miRNA)是一種游離短鏈非編碼RNA，研究表明miRNA參與調(diào)控多種生命活動，某些miRNA能夠影響腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。研究表明miR155通過泛素化途徑促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]，而miR181家族通過參與調(diào)控腫瘤細胞自噬和促進腫瘤耐藥的發(fā)生在腫瘤生長中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明miR155、miR181在許多腫瘤疾病中表達升高[7]，但與ALL的相關(guān)研究較少。本研究通過檢測ALL患兒外周血中單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miR-155及miR181的表達水平，分析其與臨床資料的相關(guān)性，旨在為ALL患兒預(yù)后的判斷提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年7月至2017年7月在本院血液科就診的51例ALL患兒作為研究組，其中男性33例、女性18例，年齡1～12(6.12±2.11)歲。ALL診斷及分型參照中華醫(yī)學(xué)會兒科分會ALL診療方案(第四次修訂)標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)過分子生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)及骨髓細胞形態(tài)學(xué)確診，排除合并其他疾病及不能耐受化療的患兒。收集ALL患兒年齡、性別等臨床資料和相關(guān)檢查指標(biāo)。另選取同期體檢正常兒童51例作為對照組，男性27例、女性24例，年齡1～11(6.33±1.56)歲。

1.2 治療及隨訪

所有患兒均依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科分會ALL診療方案(第四次修訂)標(biāo)準(zhǔn)[8]采用VDLP(長春新堿+柔紅霉素+門冬酰胺+強的松)等方案依次進行化療，化療期間嚴(yán)密監(jiān)控防止出現(xiàn)不良反應(yīng)。療程結(jié)束后依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科分會ALL診療方案(第四次修訂)標(biāo)準(zhǔn)[8]對化療效果進行評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)和復(fù)發(fā)。采用門診隨訪、電話隨訪等方式，每間隔3個月隨訪1次，末次隨訪時間2020年7月。

1.3 外周血中PBMC的分離及RNA的提取

研究組患兒于化療前后采集外周血，對照組兒童于體檢時采集外周血。無菌采集外周血5 ml于肝素抗凝管中，離心去除血漿，加入等體積生理鹽水稀釋。向淋巴細胞分離液(Ficoll，瑞典GE Healthcare公司)中緩慢滴加經(jīng)稀釋的外周血，780 g×30 min離心。結(jié)束后吸取中層白膜層細胞即為PBMC。生理鹽水洗滌細胞，加入1 ml Trizol(上海酶聯(lián)生物公司)，保存于-80 ℃中。檢測時取出EP管置于冰面解凍，提取細胞總RNA，使用NanoDrop 2000測量，OD260/OD280>1.8說明所提取RNA質(zhì)量較高，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板進行檢測。

1.4 RT-PCR技術(shù)檢測PBMC中miR-155、miR181水平

反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.8 μL、q-PCR Mix反應(yīng)液10.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃ 30 s、54 ℃ 60 s、70 ℃ 60 s，共進行40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參采用2-ΔΔCt法測定PBMC中miR-155及miR181的相對表達量。所有引物均委托上海生工生物公司合成。miR-155引物：F：5’-GCCGCTTAATGCTAATCGT-G-3’，R：5’-CAGTGCTGGGTCCGACTGA-3’；miR-181引物：F：5’-GCCGAGAACATTC-ATTGCTGT-3’，R：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 2組PBMC中miR-155、miR-181相對表達水平比較

化療前研究組患兒外周血來源PBMC中miR-155、miR-181表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 2組兒童外周血PBMC中miR-155、miR-181相對表達水平比較

2.2 ALL患兒化療前miR-155、miR-181水平與臨床資料的關(guān)系

結(jié)果顯示外周血來源PBMC中miR-155、miR-181相對表達量與患兒年齡、性別及有無肝脾腫大無關(guān)(P>0.05)，但與患兒白細胞計數(shù)、LDH及CA-125水平相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 ALL患兒化療前PBMC中miR-155、miR-181相對表達量與臨床資料的關(guān)系

2.3 ALL患兒PBMC中miR-155、miR-181水平與化療效果的關(guān)系

51例ALL患兒化療效果：CR 27例、PR 7例、NR 9例及復(fù)發(fā)8例。化療后CR組、PR組、NR組及復(fù)發(fā)組的ALL患兒PBMC中miR-155、miR-181相對表達水平具有明顯差異(P<0.001)，其中CR、PR組患兒PBMC中miR-155、miR-181相對表達水平明顯低于復(fù)發(fā)組患兒，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 化療后不同效果組患兒PBMC中miR-155、miR-181水平比較

2.4 ALL患兒PBMC中miR-155、miR-181水平與預(yù)后的關(guān)系

本研究截止到最后一次隨訪，51例ALL患兒存活36例，死亡11例，失訪4例，存活率為70.59%。所有死亡患兒均死于ALL復(fù)發(fā)及并發(fā)癥，無其他原因?qū)е碌乃劳霾±??；熐巴庵苎狿BMC中miR-155表達水平上升的患兒共27例、死亡6例、失訪2例；表達水平未升高的患兒24例、死亡5例、失訪2例。miR-181表達水平上升的患兒共29例、死亡7例、失訪3例；表達水平未升高的患兒22例、死亡4例、失訪1例。采用Kaplan-Meier法對患兒進行生存分析，結(jié)果顯示外周血PBMC中miR-155、miR-181表達水平上升患兒的生存率明顯低于表達水平正常者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 PBMC中miR-155、miR-181表達水平與患兒預(yù)后的關(guān)系

3 討論

miRNA是一種短鏈非編碼RNA，通過多種途徑調(diào)控機體生命活動。有研究表明miRNA水平與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在腫瘤細胞增殖和凋亡過程中扮演重要角色[9]。一些miRNA可作為腫瘤疾病的標(biāo)志物而被廣泛研究，而miR-155在免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)和造血系統(tǒng)中發(fā)揮的作用被逐漸認知[10]。國內(nèi)學(xué)者Cui等的研究表明miR-155表達受到原癌基因B細胞真核簇(B-cell-integration cluster，BIC)的影響[11]，miR-155表達水平升高常提示細胞增殖活性上升，凋亡減少。已有研究證明miR-155在乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌[12-14]等實體腫瘤中的表達水平常與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。相關(guān)動物實驗表明轉(zhuǎn)染miR-155后可誘發(fā)小鼠白血病的發(fā)生[15]，進一步證明了miR-155的促癌作用。miR-181是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，近年來對其研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者miR-181常呈高表達。研究表明miR-181在胃癌患者血清中水平升高，且與患者腫瘤分期相關(guān)[16]；而在晚期肝細胞癌患者中miR-181表達常高于早期患者[17]。miR-181高表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但機制尚不明確。在本研究中ALL患兒外周血PBMC中miR-155及miR-181表達水平明顯高于對照組，提示miR-155及miR-181與兒童ALL的發(fā)病密切相關(guān)，但機制仍需要進一步研究。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，兒童ALL的治療效果明顯提高，5年生存率顯著提高，但復(fù)發(fā)率仍較高。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)化療后不同組患兒外周血PBMC中miR-155、miR-181具有明顯差異，而復(fù)發(fā)組患兒miR-155、miR-181水平明顯高于CR和PR組，提示外周血PBMC中miR-155、miR-181水平可在一定程度反映化療效果，高表達者易復(fù)發(fā)。文獻報道高表達miR-181的肝癌患者易發(fā)生化療耐藥，可能與miR-181參與調(diào)控腫瘤細胞自噬相關(guān)[18]，研究表明miR-181通過靶向STAT3/Bcl-2/Beclin 1通路影響細胞自噬水平誘導(dǎo)腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生[19]。而miR-155被證實在宮頸癌中以調(diào)控炎癥的方式提高細胞自噬水平，miR-155高表達還能夠抑制PDK1/mTOR信號通路促進p62蛋白的表達以促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[20]。miR-155、miR-181高表達導(dǎo)致患兒易復(fù)發(fā)的機制尚不明確，可能是改變外周血中PBMC自噬水平及相關(guān)通路的結(jié)果。

miR-155水平可作為多種腫瘤預(yù)后的評價指標(biāo)，而miR-155高表達常被認為是預(yù)后不良的象征[21]。臨床研究表明血清中miR-155高表達的乳腺癌患者生存率低于低表達患者[22]，本研究還發(fā)現(xiàn)外周血PBMC中miR-155、miR-181高表達的ALL患兒預(yù)后較差，與miR-155、miR-181正常表達患兒相比生存率明顯下降，研究結(jié)果與報道相符。

綜上所述，ALL患兒外周血PBMC中miR-155、miR-181水平明顯升高，CR、PR組患兒PBMC中miR-155、miR-181水平低于復(fù)發(fā)組，miR-155、miR-181高表達患兒生存率較低。但本研究中樣本量較少，隨訪時間較短，需要在后續(xù)研究中進行改進，而miR-155、miR-181與ALL發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制仍需進一步研究。