梅與山桃遠緣雜交親和性初步研究

王翠梅，董然然，王一蘭，袁 濤，陳瑞丹

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京林業(yè)大學 園林學院，北京100083）

梅（Prunus mume）是中國傳統(tǒng)名花，同時也是中國第一種獲得國際品種登錄權(quán)的花卉，距今已有7 000多年的應用史和3 000多年的栽培史［1］。梅自古就以寒中開放的特性受到中國人民的喜愛，但梅花的抗寒能力并沒有人們想象的那么強。梅的露地栽植范圍大致以黃河為北界，以珠江為南界［2］，因此中國北方人民無緣欣賞到梅花。中國梅花工作者自20世紀中期開始培育抗寒梅花品種，通過引種馴化、實生選種的方式株選出‘北京玉蝶’（P．mume‘Bei jingYudie’）和‘北京 小’梅（P．mume‘Beijing Xiaomei’）等真梅系抗寒梅花品種［3］，可以在北京露地越冬。20世紀80年代開始的遠緣雜交育種育成了‘燕杏’梅（P．mume‘Yanxing’）、‘花蝴蝶’（P．mume‘Hua Hudie’）、‘山桃白’（P．mume‘Shantaobai’）梅等杏梅系品種［4－5］，并成功引種‘淡豐后’（P．mume‘Dan Fenghou’）等13 個品種。陳瑞丹以培育芳香抗寒梅花品種為目標，通過雜交育種成功培育出芳香抗寒的梅花新品種‘香瑞白’梅（P．mume‘Xiang Ruibai’）［6］。但 這 些 品 種 雖 抗 寒 性強，但開花較晚，在北京及以北地區(qū)自然花期在3月下旬至4月初，不能體現(xiàn)梅早花的特性，降低了其觀賞性。因此，如何提早抗寒梅花的花期是目前育種工作者迫切需要解決的問題。

種間遠緣雜交是植物種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的重要途徑之一［7］，遠緣雜交后代有明顯的雜種優(yōu)勢，通過遠緣雜交獲得抗逆性強、觀賞價值高的植物新品種是育種家追求的目標，‘燕杏’梅、‘花蝴蝶’梅、‘山桃白’梅等都是通過遠緣雜交獲得的，抗寒性極強。但不同物種間存在一定的生殖隔離，遠緣雜交常表現(xiàn)為雜交不親和性和雜種不育性，難以獲得雜種后代［8］。為提早抗寒梅花的花期，使北國人民也能感受到梅花的韻味，本研究開展了梅與山桃、‘白花’山桃的雜交育種工作。選擇自然結(jié)實率高且抗寒（能在北京地區(qū)露地栽植）的真梅品種‘江梅’、杏梅品種‘淡豐后’為母本。山桃（P．davidiana）和‘白花’山桃（P．davidiana‘Alba’）抗寒性強，是北京地區(qū)花期最早的梅花同屬植物，且前人已獲得山桃和‘小綠萼’梅（P．mume‘Xiao Lv，e’）的雜交種‘山桃白’梅［5］，因此選擇山桃和‘白花’山桃作為本試驗的父本。對雜交結(jié)實率、授粉后花粉在柱頭的萌發(fā)以及花粉管的生長過程進行觀察，探討各雜交組合的親和性，并對未成熟胚進行培養(yǎng)，為梅花的遠緣雜交育種工作提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

雜交試驗于2014年3月下旬至4月上旬在青島梅園進行，熒光觀察和胚培養(yǎng)試驗在北京林業(yè)大學實驗室進行。雜交母本樹為青島梅園生長健壯的‘江梅’、‘淡豐后’梅，父本為北京林業(yè)大學校園內(nèi)多年生且生長健壯的山桃和‘白花’山桃，雜交組合為‘江梅’×山桃、‘江梅’ב白花山’桃，‘淡豐后’×山桃、‘淡豐后’ב白花’山桃。授粉在3月底～4月上旬，上午9：30～11：00，天氣晴好，無風或微風，溫度10 ℃～20 ℃。

1．2 授粉方法

1．2．1 花粉的采集和貯藏 3月初山桃、‘白花’山桃開花前，采集氣球期花蕾，在室內(nèi)通風條件下自然陰干散粉后，收集花粉置于裝有變色硅膠的干燥管中，－20 ℃條件下冰凍保存。

1．2．2 花粉生活力的測定 授粉前采用懸滴培養(yǎng)法測定花粉的活力。培養(yǎng)基為5%蔗糖＋10μg／mL硼酸，24 ℃下培養(yǎng)6h。測得山桃花粉發(fā)芽率為55%、‘白花’山桃為60%，均可用于授粉。

1．2．3 雜交授粉方法 3月底～4月上旬梅花初開時，先對大蕾期母本用連被去雄法去雄，即用大拇指和食指將萼片、花瓣和雄蕊一次性撕掉的去雄方法，同時授以父本花粉并套袋掛牌，每朵花重復授粉2次。

1．3 花粉管生長行為觀察

授粉后4、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h取樣，每組合隨機選取授粉后的花柱20 個，用FAA 固定液（甲醛∶冰醋酸∶70%酒精＝1∶1∶18，V／V）固定24h以上，4 ℃冰箱保存。

花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管行為觀察：經(jīng)FAA固定液固定的雌蕊，先用蒸餾水沖洗3次，然后放入8mol／L NaOH 溶液中軟化4h，蒸餾水沖洗干凈后，放入含0．1mol／L K3PO4的0．1%的水溶性苯胺藍溶液中染色1h。然后將花柱放于載玻片上，蓋玻片輕輕壓平。在Olympus熒光顯微鏡下觀察記錄花粉管生長情況。

1．4 雜交結(jié)實率比較及雜種幼胚拯救

授粉1 周后，拆除套袋，用紗網(wǎng)裹住授粉的大枝，防止果實掉落。之后每隔15d 統(tǒng)計1 次座果率，直至果實成熟。

2014年6月采收授粉后60d左右的果實，將梅果肉洗凈，砸開種核，取出種仁，置于流水下沖洗30 min，在超凈工作臺上將種仁先后用70%酒精和1%次氯酸鈉溶液消毒30s和25min，每次消毒后均用無菌水沖洗3～5次，去除內(nèi)種皮，取帶1／4子葉的幼胚 接 種 于①2／3WPM ＋0．5 mg／L IBA＋2．0 mg／L 6－BA＋0．5g／L 活性炭＋40g／L 蔗糖＋7 g／L瓊脂和②WPM＋0．5mg／L IBA＋2．0mg／L 6－BA＋0．5g／L 活性炭＋40g／L 蔗糖＋7g／L 瓊脂，pH 5．8～6．0的培養(yǎng)基中，置于2 ℃～4 ℃的冰箱中低溫黑暗處理90d，然后轉(zhuǎn)入光照組培室［溫度（23＋2）℃，濕度60%左右，光照強度1 500～2 000 lx，光照14h／d］中培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)情況適時打開煉苗，煉苗后移栽至花盆中（7cm×7cm），移栽基質(zhì)為珍珠巖∶進口泥炭土∶河沙＝1∶1∶1（V／V），基質(zhì)使用前用高溫滅菌鍋120 ℃滅菌2h。移栽后置于人工氣候箱（白天25℃，晚上20℃，光照16h／d，濕度60%，光照80%）培養(yǎng)，觀察記錄雜交種子萌發(fā)情況。

結(jié)實率＝（獲得果實數(shù)／授粉花數(shù)）×100%

幼胚萌發(fā)率＝（萌發(fā)的胚數(shù)／接種數(shù)）×100%

敗育率＝（敗育的胚數(shù)／接種數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2．1 梅與山桃、‘白花’山桃種間雜交結(jié)實性

由表1可以看出，各雜交組合結(jié)實率都很低，在‘江梅’ב白花’山桃的雜交組合中，未能獲得雜交果實，表現(xiàn)為種間遠緣雜交不親和性。‘江梅’和山桃雜交結(jié)實率只有0．7%，雜交親和性很低。結(jié)實率較高的是以‘淡豐后’為母本的兩個組合，分別為3．1%和7．4%。授粉后35d左右出現(xiàn)嚴重的落果現(xiàn)象，落果率高達90%，落果現(xiàn)象可能是由胚發(fā)育不正常造成的，且收獲的果實大多不飽滿，這種未成熟的果實即使沙藏后播種，也不能萌發(fā)。作者于2013年1月播種沙藏后的雜交種子，均未萌發(fā)，砸開種核發(fā)現(xiàn)里面的種仁已腐爛。分析原因認為，梅果實發(fā)育快、時間短，果實達到成熟時，胚還尚未成熟，尤其是遠緣雜交由于親和力的關(guān)系，胚后期發(fā)育不良，萌芽力很低。因此，雜交種子采取播種的方法在本試驗中不能使用，必須采用更有效的試驗方法進行胚拯救。

2．2 梅與山桃、‘白花’山桃授粉后花粉管行為觀察

授粉后，山桃和‘白花’山桃的花粉粒在梅柱頭上4～8h均能萌發(fā)，但花粉粒的萌發(fā)情況和花粉管的生長有很大差異。‘江梅’×山桃，4h 后觀察到少量山桃花粉粒能夠在‘江梅’柱頭萌發(fā)，8h 后萌發(fā)量增加（圖版Ⅰ，1），但12h后即觀察到柱頭乳突細胞出現(xiàn)胼胝質(zhì)塞（圖版Ⅰ，2），48h 后停止生長，花粉管頂端膨大、彎曲，未能進入子房（圖版Ⅰ，3），不能完成授精作用；‘江梅’ב白花’山桃，‘白花’山桃的花粉粒在‘江梅’柱頭上8h后僅有少量萌發(fā)，且伴隨有大量的胼胝質(zhì)沉積，花粉管末端發(fā)生彎曲、斷裂、纏繞（圖版Ⅰ，4），未能正常生長；‘淡豐后’×山桃，4h后即能大量萌發(fā)（圖版Ⅰ，5），8h后觀察到花粉管已開始深入花柱，48h 后到達花柱中部，但此后花粉管不再伸長（圖版Ⅰ，6），未能進入子房；‘淡豐后’ב白花’山桃，4h后觀察到花粉粒開始萌發(fā)（圖版Ⅰ，7），12h 大量萌發(fā)，在花柱中延伸生長（圖版Ⅰ，8），96h后觀察到花粉管進入子房（圖版Ⅰ，9）。

以‘江梅’為母本的兩個雜交組合，雖然花粉粒能在梅柱頭萌發(fā)，但均未觀察到花粉管進入到子房，不能完成授精作用，存在授精前障礙；在以‘淡豐后’為母本的組合中，‘白花’山桃的花粉粒能夠在雌蕊柱頭萌發(fā)，沿花柱延伸，最后進入子房，完成授精作用，導致結(jié)實率低的原因是在果實發(fā)育中，胚敗育導致大量落果。

2．3 幼胚培養(yǎng)萌發(fā)情況

由于2013年播種雜交種子均未萌發(fā)，因此本次試驗種子處理采用胚培養(yǎng)的方法獲得雜種苗。如表2中所示，接種數(shù)和結(jié)實數(shù)不一致的原因是雜交親和性低、雜種存在嚴重敗育的情況，并不是所有果實里都有飽滿的胚，有的是干癟的胚，有的是水漬狀非正常的胚。遠緣雜交極低的結(jié)實率以及胚敗育導致最后能接種的幼胚極少。

表1 梅與山桃、‘白花’山桃種間雜交結(jié)實性比較Table 1 Fertility of interspecific crosses between P．mume and P．davidianaor P．davidiana‘Alba’

表2 梅與山桃 白花 山桃雜交幼胚培養(yǎng)萌發(fā)情況Table 2 Germination of immature embryo between P．mume and P．davidianaor P．davidiana‘Alba’

放置2 ℃～4 ℃的冰箱低溫培養(yǎng)，每周觀察一次萌發(fā)情況。低溫培養(yǎng)50～55d后，雜種B、C胚開始萌動，幼芽呈現(xiàn)淡黃綠色，這與黑暗培養(yǎng)有關(guān)，未能進行光合作用，70d后胚根伸長約1cm。低溫90 d后轉(zhuǎn)入光照組培室培養(yǎng)，1～2d后，幼葉開始轉(zhuǎn)綠、伸展，根伸長生長（圖版Ⅰ，10、11）。5d后已長出數(shù)條二級根，此時打開三角瓶上的封口膜，煉苗5 d后移栽入盆，置于人工氣候箱中生長，每天觀察生長情況，視具體情況定時澆水。移栽2周后，雜種苗苗高達5～8cm（圖版Ⅰ，12、13），雜種B 從葉形上已完全表現(xiàn)出父本的特性（圖版Ⅰ，12），可以初步鑒定為‘淡豐后’和山桃的雜交后代。在人工氣候箱中培養(yǎng)5～6月后，待植株生長健壯，且天氣轉(zhuǎn)暖后，換大盆移栽至露地生長。

通過未成熟胚培養(yǎng)獲得了梅與山桃的雜種苗，說明胚培養(yǎng)是獲得種間雜種苗的有效途徑。

3 討 論

種間遠緣雜交是培育新品種的重要途徑之一，但是種間雜交存在不親和性以及雜種不育是遠緣雜交育種中的兩大障礙。

張啟翔［9］曾觀察了山桃花粉粒在‘小綠萼’梅、‘大羽’梅等真梅品種柱頭上的萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)山桃花粉和梅柱頭之間不存在不親和反應，都能在柱頭表面萌發(fā)。本研究也觀察到類似的現(xiàn)象，本試驗4個雜交組合，花粉粒均能在雌蕊柱頭上萌發(fā)，說明梅和山桃種間雜交柱頭表面不存在不親和反應，除了‘淡豐后’ב白花’山桃組合觀察到花粉管進入子房，其他組合都未觀察到花粉管進入子房，分析最后未能完成授精的原因，可能是和花柱中的某些物質(zhì)發(fā)生識別障礙。Knox［10］通過研究楊屬種間雜交提出了主動識別的概念，認為柱頭識別出不親和的花粉壁蛋白后在乳突細胞內(nèi)迅速產(chǎn)生胼胝質(zhì)，阻止花粉管繼續(xù)生長進入子房。本試驗通過熒光觀察，發(fā)現(xiàn)山桃和‘白花’山桃的花粉授于‘江梅’柱頭后，花粉管生長緩慢，均在花柱中產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)。分析原因可能是花粉粒與雌蕊柱頭識別過程中，柱頭存在抑制物質(zhì)，阻礙花粉管的生長，誘導產(chǎn)生胼胝質(zhì)［11］，這是生物物種為了維持種間生殖隔離達到保存種性的目的［12］。不同雜交組合其結(jié)實率也存在差異，‘江梅’與‘白花’山桃雜交結(jié)果率為0，通過花粉管生長行為的觀察，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在授精前障礙。結(jié)實率較高的為‘淡豐后’和山桃、‘白花’山桃之間的雜交，且不同親本對雜種胚的萌發(fā)率也有影響。梁青等通過研究甜櫻桃和中國櫻桃的遠緣雜交發(fā)現(xiàn)不同親本對雜交座果率和雜種胚的萌發(fā)生長率均有顯著影響［13］，這可能是由遺傳背景不同造成的。

遠緣雜交獲得的果實由于親和力差的原因，胚后期發(fā)育不良，即使通過沙藏后播種也未萌發(fā)，砸開種核發(fā)現(xiàn)種仁已腐爛。本試驗獲得雜交果95個，種仁不飽滿或干癟率為47．4%，因此很難用常規(guī)播種方法獲得雜種苗。胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展有效地解決了這個問題［14］，通過胚拯救已獲得杏和桃、李等的雜種苗［15－16］。本試驗也有力地證明了胚培養(yǎng)技術(shù)在遠緣雜交育種中的重要作用，通過胚培養(yǎng)共獲得雜種苗13株，表明幼胚拯救是獲得種間雜種苗、提高雜交成功率的重要途徑。

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Explanation of plate：

PlateⅠ Fig．1－9．Pollen germination and pollen tube growth in different cross combinations between P．mume and P．davidiana：Fig．1．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，pollen germinated 4hafter pollination，×200；Fig．2．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，callose accumulated 8hafter pollination，×100；Fig．3．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，the end of pollen tube bended and swelled，×100；Fig．4．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube bended，twined and fractured 48hafter pollination，×100；Fig．5．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana，a lot of pollen germinated on the stigma，×100；Fig．6．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana，pollen tube arrived at the middle of style 48hafter pollination，×100；Fig．7．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen germinated 4hafter pollination，×200；Fig．8．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube prolongated in the style 12hafter pollination，×100；Fig．9．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube stretched into the ovary 96hafter pollination，×400．Fig．10－13．Embryo culture and hybrid：Fig．10．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’；Fig．11．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana；Fig．12．Hybrid of P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana；Fig．13．Hybrid of P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’．

圖版Ⅰ 1～9．不同雜交組合花粉萌發(fā)和花粉管生長過程熒光觀察：1．‘江梅’×山桃，4h花粉粒萌發(fā)，×200；2．‘江梅’×山桃，8h后胼胝質(zhì)沉積，×100；3．‘江梅’×山桃，花粉管末端彎曲、膨大，×100；4．‘江梅’ב白花’山桃，48h后花粉管彎曲、纏繞、斷裂，×100；5．‘淡豐后’×山桃，4h后花粉粒在柱頭大量萌發(fā)，×100；6．‘淡豐后’×山桃，48h后花粉管進入花柱中部，×100；7．‘淡豐后’ב白花’山桃，4h后花粉萌發(fā)，×200；8．‘淡豐后’ב白花’山桃，12h花粉管在花柱中延伸，×100；9．‘淡豐后’ב白花’山桃，96h后進入子房，×400。10～13．胚培養(yǎng)及雜種苗：10．‘淡豐后’ב白花’山桃雜種胚培養(yǎng)情況；11．‘淡豐后’×山桃雜種胚培養(yǎng)情況；12．‘淡豐后’×山桃雜種苗；13．‘淡豐后’ב白花’山桃雜種苗。