鹽脅迫下鹽穗木甘油醛－3－磷酸脫氫酶基因的表達(dá)與亞細(xì)胞定位分析

張 霞，張 樺，張富春

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；2 新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊

830046）

甘油醛－3－磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase；GAPDH）為糖酵解關(guān)鍵酶之一［1］。在哺乳動物細(xì)胞中，GAPDH 除了參與糖酵解途徑外，還參與多種非代謝類生物過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 修復(fù)、信號傳導(dǎo)、自噬和凋亡［2－5］。最近研究表明H2O2或脫落酸（ABA）處理會抑制擬南芥（Arabidopsis thaliana）GAPDH（AtGAPDH）作為甘油醛－3－磷酸脫氫酶的酶活性，這種失活的GAPDH 蛋白會提高磷脂酸（PA）的含量，后者可以作為信號分子參與對干旱或ROS 等脅迫產(chǎn)生應(yīng)答［6］。在眾多植物中，如匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、黃瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum chilense）等，GAPDH 均被鑒定為鹽脅迫誘導(dǎo)蛋白［7］；前期工作中，通過藜科（Chenopodiaceae）鹽穗木（Halostachyscaspica）鹽脅迫下抑制差減文庫獲得鹽脅迫相關(guān)基因，其中包括甘油醛－3－磷酸脫氫酶（HcGAPDH，GenBank Accession No．Hs586460）［8］，表明GAPDH 參與植物鹽脅迫應(yīng)答在植物界是一個普遍現(xiàn)象。此外，在植物中，碳水化合物的水平將植物外界環(huán)境狀況與細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育進(jìn)程聯(lián)系在一起［9－10］。而GAPDH 作為糖酵解途徑中的酶，在動物細(xì)胞中能夠精準(zhǔn)感受到細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的水平［1］。Zheng等［3］推斷GAPDH 可能作為一種信號分子，通過細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的亞細(xì)胞定位的改變，將人源細(xì)胞質(zhì)中氧化狀態(tài)（或是新陳代謝狀態(tài)）與一些相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄聯(lián)系在一起。雖然蛋白質(zhì)學(xué)和瞬時表達(dá)綠色熒光蛋白融合蛋白的研究表明擬南芥GAPDH 蛋 白 在 脅 迫 中 定 位 于 細(xì) 胞 核 中［11－13］。但GAPDH 是否在生物界（包括植物和動物）中具有相同生理功能還有待進(jìn)一步探討。

鹽穗木為多汁半灌木、荒漠主要組成植物之一，鹽穗木群系為塔里木河中下游區(qū)域耐鹽性最強(qiáng)的植物種群［14］。其隸屬的藜科包含世界上大多數(shù)鹽生植物種類［15］，故鹽穗木是一種典型的鹽生植物。目前對于大多數(shù)鹽生植物的研究還處于起步階段，多集中在轉(zhuǎn)錄本、抑制差減文庫、或蛋白文庫等大規(guī)模批 量基因 篩 選 層 面［8，16，17］，對 于 單 個 基 因 或 蛋 白 的功能研究較少。為了研究HcGAPDH 在鹽穗木鹽脅迫應(yīng)答中的作用，首先通過RACE 技術(shù)獲得Hc－GAPDH 全長cDNA 序列，并借用實(shí)時定量PCR檢測了HcGAPDH 在鹽穗木逆境脅迫中的轉(zhuǎn)錄水平，同時借助轉(zhuǎn)基因和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測不同生理狀態(tài)下HcGAPDH 的亞細(xì)胞定位。本研究為深入探討HcGAPDH 在鹽穗木鹽脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 植物材料及脅迫處理

擬南芥（Col生態(tài)型）生長在22 ℃、16h光照／8 h黑暗、60%濕度培養(yǎng)箱中。鹽穗木種子采自新疆北沙窩鹽堿地，手工去掉種子外殼，篩凈，進(jìn)行濕種子滅菌（75%乙醇表面消毒1min，0．1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗7遍以上）。用滴管將處理好的鹽穗木種子點(diǎn)在MS固體培養(yǎng)基中，用封口膜封緊；4℃3d后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，期間采用變溫培養(yǎng)（正常光照，28 ℃16h；無光照，16 ℃8h）。4 周大的幼苗分別在150 mmol／L NaCl和100μmol／L ABA 的平皿中放置0、3、6、12和24h，用液氮將鹽穗木幼苗收集，置－80 ℃待用。

1．2 實(shí)時定量PCR（RT－PCR）

采用植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）提取鹽穗木全株總RNA，置于－80 ℃冰箱保存。按PrimeScript RT－PCR試劑盒（TaKaRa）的操作指南進(jìn)行cDNA 合成。實(shí)時定量PCR 由Rotor－Gene 7500實(shí)時定量PCR 儀（Corbett Research，澳大利亞）完成。選擇鹽穗木actin 基因作為內(nèi)參基因，鹽穗木BURP家族的脫水脅迫蛋白22（HcRd22）作為脅迫處理鹽穗木的標(biāo)記基因［18］，采用SYBRRrogen I real－time PCR 體系（invitrogen）進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30s；95 ℃變性5s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共40個循環(huán)。在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。使用2－ΔΔCt方法［19］計(jì)算相對表達(dá)量。3個重復(fù)。

1．3 基因克隆與擬南芥轉(zhuǎn)化

根據(jù)鹽穗木鹽脅迫下抑制差減文庫中分離獲得HcGAPDH 基因的表達(dá)標(biāo)簽（EST）片段［8］，利用SMARTer RACE5’／3’Kit（invitrogen）試劑盒，通過RACE技術(shù)，進(jìn)一步克隆獲得HcGAPDH 基因全長cDNA 序列。將兩端帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)HcGAPDH 基因的開放閱讀框（ORF）片段連接至pEGAD 雙元載體，最終產(chǎn)生HcGAPDHGFP 融合片段。將測序正確的載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，并通過真空滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥［20］。所獲得種子在含有50μg／mL Basta的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，最終獲得pEGAD／HcGAPDH 轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥。所用引物見表1。

1．4 綠色熒光蛋白檢測

將上述的pEGAD／HcGAPDH 轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥植株，在含有抗生素的培養(yǎng)基上培育7d后，挑取陽性植株置于含3%葡萄糖的MS培養(yǎng)基處理12 h后，放置載玻片上，用熒光共聚焦顯微鏡觀測。圖像由FV10－ASW 1．7A 軟件（Olympus Corp．，http：／／www．olympusamerica．com／）處理。

表1 引物序列表Table 1 Table of primer pairs

2 結(jié)果與分析

2．1 HcGAPDH 的序列分析

根據(jù)抑制差減文庫中分離的基因EST 序列［8］，通過RACE技術(shù)克隆獲得1 381bp的HcGAPDH全長cDNA 序列，其ORF 編碼314個氨基酸。利用Clustalw 序 列 比 對 軟 件（http：／／www．ebi．a(chǎn)c．uk／Tools／msa／clustalw2／）預(yù)測該基因氨基酸序列與已報告的GADPH 家族成員具有高度保守性，故將該基因命名為HcGAPDH（圖1，A）。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域 在 線 分 析 軟 件（http：／／myhits．isb－sib．ch／cgi－bin motif＿scan）結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HcGAPDH 具有2個不同的結(jié)構(gòu)域：位于N 端包含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域（4～154）；位于C 端包含有2 個甘油醛－3－磷酸（Glyceraldehyde 3－phosphate）結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域（156～314），這2個結(jié)構(gòu)域均與GAPDH 作為水解酶的活性具有相關(guān)性（圖1，B）。因此，本實(shí)驗(yàn)所克隆的HcGAPDH可被認(rèn)為是GAPDH 基因家族成員之一。

2．2 HcGAPDH 在鹽脅迫和ABA 處理下的表達(dá)

圖1 HcGAPDH 與其他物種GAPDH 蛋白序列比對（A）及其保守結(jié)構(gòu)域分析（B）Fig．1 Alignment of full－length deduced amino acid sequences of HcGAPDH and GAPDH orthologues from different phylogenetic origins（A）and the structure of the conserved regions（B）of HcGAPDH protein．

為研究HcGAPDH 表達(dá)是否受鹽脅迫和植物抗逆激素ABA的影響，通過實(shí)時定量RT－PCR技術(shù)，檢測4周齡鹽穗木在鹽脅迫和激素ABA 處理下Hc－GAPDH 的表達(dá)。結(jié)果表明，內(nèi)參基因HcRd22［17］的基因表達(dá)量隨著鹽脅迫或ABA 處理時間的延長呈上調(diào)趨 勢（圖2）。在ABA 脅 迫 處 理3 和6h 時，HcRd22轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢，但與對照組相比差異不顯著；在ABA 脅迫處理12h時，HcRd22表達(dá)量達(dá)到最大值，且與對照組相比差異顯著。相比之下，HcGAPDH 表達(dá)在鹽脅迫6h時達(dá)到最高峰，隨后降低。50μmol／L ABA處理使得HcGAPDH 表達(dá)在脅迫12h內(nèi)呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，在12h時達(dá)到最高值（圖2）。總之，這些結(jié)果表明HcGAPDH 基因的轉(zhuǎn)錄水平受鹽脅迫和ABA 處理調(diào)節(jié)。

圖2 鹽脅迫（A）和ABA（B）處理下HcGAPDH 表達(dá)＊和＊＊分別表示0．05和0．01水平顯著性差異Fig．2 qPCR analysis of the expression of HcGAPDH with NaCl（A）or ABA（B）treatments＊and＊＊ mean significant differences at 0．05and 0．01levels，respectively．

圖3 鹽脅迫下HcGAPDH 在轉(zhuǎn)基因植株根部組織的亞細(xì)胞定位Fig．3 Subcellular－localization of HcGAPDH in the root of transgenic seedlings under salt stress

圖4 糖缺乏下HcGAPDH 在轉(zhuǎn)基因植株根部組織細(xì)胞的亞細(xì)胞定位Fig．4 Subcellular－localization of HcGAPDH in the root of transgenic seedlings under sugar starvation

2．3 鹽脅迫下HcGAPDH 的亞細(xì)胞定位

動物GAPDH 在不同生理狀況下具有不同亞細(xì)胞定位［3，5］。為檢測HcGAPDH 在鹽脅迫下是否具有亞細(xì)胞定位的改變，將在MS 培養(yǎng)基生長7d的HcGAPDH－GFP 和GFP 轉(zhuǎn) 基 因 植 株，分 別 用200mmol／L NaCl處理24h后，進(jìn)行GFP 熒光觀測（圖3）。結(jié)果顯示，在正常生長狀況下，GFP－Hc－GAPDH 蛋白熒光信號主要集中在轉(zhuǎn)基因植株根部細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)用200mmol／L NaCl處理12 h后，對照組GFP 蛋白主要分布于細(xì)胞周質(zhì)中，而GFP－HcGAPDH 蛋白則明顯地聚集在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的細(xì)胞核中，而在細(xì)胞質(zhì)分布較少，表明鹽脅迫可促使HcGAPDH 蛋白在植物細(xì)胞核中富集。

2．4 HcGAPDH 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中不依賴于碳水化合物介導(dǎo)的信號反饋通路

為檢測碳水化合物的匱乏是否是鹽脅迫下植物GAPDH 改變亞細(xì)胞定位至細(xì)胞核的誘因之一，將7d大的HcGAPDH－GFP 轉(zhuǎn)基因植株置于有3%葡萄糖的MS培養(yǎng)基上處理12h后，在共聚焦顯微鏡下觀測其亞細(xì)胞定位。結(jié)果（圖4）顯示，與含有葡萄糖的培養(yǎng)基上生長的幼苗相比，在糖缺乏培養(yǎng)基上幼苗的GFP熒光信號明顯下降，而且熒光信號仍集中分布于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號累積。這些結(jié)果暗示了糖信號介導(dǎo)Hc－GAPDH 蛋白自身的周期控制，該過程不同于鹽脅迫應(yīng)答過程的HcGAPDH 亞細(xì)胞定位改變。

3 討 論

GAPDH 作為糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵酶之一，長期以來被認(rèn)為是在同種細(xì)胞或組織中恒定表達(dá)且只存在于細(xì)胞質(zhì)中的管家基因產(chǎn)物。然而最近研究表明在動物細(xì)胞中，GAPDH 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平會隨著各種環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化［4，21］，且可以定位于除細(xì)胞質(zhì)之外的質(zhì)膜、細(xì)胞核、多聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體上［22－25］。而在植物細(xì)胞中，鹽脅迫處理的鹽生植物西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）中PsGAPDH 也發(fā)現(xiàn)同樣的上調(diào)表達(dá)［26］。在本研究中，鹽脅迫和ABA 處理同樣也可誘導(dǎo)鹽生植物鹽穗木HcGAPDH 的基因表達(dá)上調(diào)。此外，鎘脅迫［13］處理可誘導(dǎo)擬南芥AtGAPDH蛋白定位于細(xì)胞核，而在本研究中發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫也可促使HcGAPDH 在轉(zhuǎn)基因植株根部細(xì)胞中由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，暗示了逆境脅迫下不同生物體內(nèi)（主要是動物和植物細(xì)胞內(nèi)）的GAPDH 也許具有相似的生理功能。

糖酵解是動植物以及微生物細(xì)胞中葡萄糖分解產(chǎn)生能量的共同代謝途徑。研究表明糖酵解過程中產(chǎn)生的能量和一些代謝物質(zhì)可用于其它生物反應(yīng)過程，這對植物在逆境中的存活至關(guān)重要［9，10］。人源HsGAPDH 已被證實(shí)通過與核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物Oct－1－OCA－S結(jié)合將細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡與細(xì)胞核中組蛋白的轉(zhuǎn)錄和DNA 復(fù)制結(jié)合在一起［3］。因此，提出植物GAPDH 作為糖酵解中酶類物質(zhì)之一，也可通過作為細(xì)胞內(nèi)代謝狀況的感應(yīng)元件參與植物鹽脅迫應(yīng)答這一假說。然而在糖饑餓的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，HcGAPDH－GFP融合蛋白并沒有在細(xì)胞核處發(fā)生明顯的熒光信號聚集現(xiàn)象，而是HcGAPDH－GFP融合蛋白的熒光信號明顯降低，本研究結(jié)果與Cotelle等［27］報道相一致，糖饑餓促使糖酵解相關(guān)酶蛋白發(fā)生降解。同時，這一結(jié)果也暗示了碳水化合物水平的改變并不是鹽脅迫下GAPDH 功能發(fā)生改變的原因，但這仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在動物體系 中，GAPDH 的 細(xì) 胞 核 定 位 與 基 因 轉(zhuǎn) 錄［5，28］具 有相關(guān)性，但這尚未在植物中有相關(guān)報道。因此植物GAPDH 通過胞內(nèi)定位的改變對植物抗逆能力的影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

［1］ PLAXTON W C．The organization and regulation of plant glycolysis［J］．Annu．Rev．Plant．Physiol．Plant．Mol．Biol．，1996，47：185－214．

［2］ HARA M R，AGRAWAL N，KIM S F，et al．S－nitrosylated GAPDH initiates apoptotic cell death by nuclear trans－location following Siah1 binding［J］．Nat．Cell Biol．，2005，7：665－674．

［3］ ZHENG L，ROEDER RG，LUO Y．S phase activation of the histone H2Bpromoter by OCA－S，a coactivator complex that contains GAPDH as a key component［J］．Cell，2003，114：255－266．

［4］ YANG Y，KWON H B，PENG H P，et al．Stress responses and metabolic regulation of glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase genes in ArabidopsisJ．Plant Physiol．19931011209－216．

［5］ SIROVER M A．Subcellular dynamics of multifunctional protein regulation：mechanisms of GAPDH intracellular translocation［J］．J Cell Biochem．，2012，113（7）：2 193－2 200．

［6］ GUO L，DEVAIAH S P，NARASIMHAN R，et al．Cytosolic glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenases interact with phospholipase Dd to transduce hydrogen peroxide signals in the Arabidopsis response to stress［J］．The Plant Cell，2012，24：2 200－2 212．

［7］ DAI S，CHEN S，WANG T，et al．Proteomics－based investigation of salt－responsive mechanisms in plant roots［J］．J．Proteomics，2013，82：230－253．

［8］ LIU L，WANG Y，ZENG Y L，et al．Identification and characterization of differentially expressed genes in the halophyte Halostachyscaspicaunder salt stress［J］．PCTOC，2012，110（1）：1－12．

［9］ LORETI E，POVERO G，NOVI G，et al．Gibberellins，jasmonate and abscisic acid modulate the sucrose－induced expression of anthocyanin biosynthetic genes in Arabidopsis［J］．New Phytol．，2008，179：1 004－1 016．

［10］ AGULLò－ANTòN M A，F(xiàn)ERRàNDEZ－AYELA A，F(xiàn)ERNàNDEZ－GARCíA N，et al．Early steps of adventitious rooting：morphology，hormonal profiling and carbohydrate turnover in carnation stem cuttings［J］．Physiol．Plant，2013，150：446－462．

［11］ BAE M S，CHO E J，CHOI E Y，et al．Analysis of the Arabidopsis nuclear proteome and its response to cold stress［J］．Plant J．，2003，36（5）：652－663．

［12］ HOLTGREFE S，GOHLKE J，STARM－ANN J，et al．Regulation of plant cytosolic glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase isoforms by thiol modifications［J］．Physiol Plantarum，2008，133：211－228．

［13］ VESCOVI M，ZAFFAGNINI M，F(xiàn)ESTA M，et al．Nuclear accumulation of cytosolic GAPDH in cadmium－stressed Arabidopsis roots［J］．Plant Physiol．，2013，162（1）：333－346．

［14］ MO ZH X（莫治新），YIN L K（尹林克）．Study on the characteristics of soil salt and ground water in the middle reaches of Tarim River［J］．Journal of Arid Resources and Environment（干旱區(qū)資源與環(huán)境），2005，19（1）：163－166（in Chinese）．

［15］ TIMOTHY J，F(xiàn)LOWERS A B E，HANAA K，et al．Evolution of halophytes：multiple origins of salt tolerance in land plants［J］．Funct Plant Biol．，2010，37：604－612．

［16］ XU J，YIN H，YANG L，et al．Differential salt tolerance in seedlings derived from dimorphic seeds of Atriplex centralasiatica：from physiology to molecular analysis［J］．Planta，2011，233（5）：859－871．

［17］ LI W，ZHANG C，LU Q，et al．The combined effect of salt stress and heat shock on proteome profiling in suaedasalsa［J］．J．Plant Physiol．，2011，168（15）：1 743－1 752．

［18］ ZHANG X（張 霞），CHANG D（常 丹），PENG D（彭 丹），et al．Cloning and expression of dehydration－respective protein gene Rd22（HcRd22）from extremely salt－tolerant plant Halostachyscaspica［J］．Biotechnology（生物技術(shù)），2013，23（6）：5－8（in Chinese）．

［19］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D．Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2（－Delta Delta C（T））Method［J］．Methods，2001，25（4）：402－408．

［20］ BECHTOLD N，PELLETIER G．In planta Agrobacterium－mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration［J］．Methods Mol．Biol．，2003，82：259－266．

［21］ BARBER R D，HARMER D W，COLE－MAN R A，et al．GAPDH as a house－keeping gene：analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72human tissues［J］．Physiol．Genomics，2005，21：389－395．

［22］ TRISTAN C，SHAHANI N，SEDLAK T W，et al．The diverse functions of GAPDH：views from different subcellular compartments［J］．Cell Signal，2011，23：317－323．

［23］ XING C，LAPORTE JR，BARBAY J K，et al．Identification of GAPDH as a protein target of the saframycin anti－proliferative agents［J］．PNAS，2004，101：5 862－5 866．

［24］ MARUAMA W，OYA－ITO T，SHAMOTO－NAGAI M，et al．Glyceraldehyde－3－phospate dehydrogenase is translocated into nuclei through Golgi apparatus during apoptosis induced by 6－h(huán)ydroxy－dopamine in human dopaminergic SH－SY5Ycells［J］．Neurosci Lett，2002，321：29－32．

［25］ STEINRITZ D，WEBER J，BALSZU－WEIT F，et al．Sulfur mustard induced nuclear translocation of glyceraldehyde－3－phosphate－dehydrogenase（GAPDH）［J］．Chem Biol Interact，2013，206（3）：529－535．

［26］ LI X Z（李曉澤），LIU G J（劉關(guān)君），YANG CH P（楊傳平）．Cloning and sequence analysis of cDNA of glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase gene fromPolygonumsibiricumLaxm［J］．Plant Physiology Communications（植物生理學(xué)通訊），2007，43（1）：41－48（in Chinese）．

［27］ COTELLE V，MEEK S E M，PROVAN F，et al．14－3－3sregulate global cleavage of their diverse binding partners in sugar－starved Arabidopsis cells［J］．EMBO J．，2000，19：2 869－2 876．

［28］ DAI R P，YU F X，GOH S R，et al．Histone 2B（H2B）expression is confined to a proper NAD＋／NADH redox status［J］．J．Biol．Chem．，2008，2 283（40）：26 894－26 901．