攜病毒馬鈴薯莖尖分化成苗與脫毒率檢測(cè)

馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

（榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000）

脫除馬鈴薯病毒和紡錘塊莖類(lèi)病毒（以下簡(jiǎn)稱(chēng)類(lèi)病毒）主要采用莖尖組織培養(yǎng)法，并結(jié)合熱處理［1］、低溫療法［2］和病毒唑法［3］等提高脫毒效果。其中，熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是一種應(yīng)用較廣的馬鈴薯脫毒方法，在葡萄、草莓和蘋(píng)果等植物上也有報(bào)道。但是，由于不用植物或同一植物不同品種基因型和生理特性的差異，莖尖分化成苗的難易程度也不一樣。筆者以蓋瓊輝等［4］、Iqbal H 等［5］研究的馬鈴薯莖尖分化成苗培養(yǎng)基作為參考，在同一培養(yǎng)基上對(duì)‘克新1號(hào)’、‘夏波蒂’、‘費(fèi)烏瑞它’、‘隴薯3號(hào)’、‘布爾班克’、‘青薯9號(hào)’、‘早大白’、‘冀張薯8號(hào)’等不同品種的莖尖培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，‘夏波蒂’馬鈴薯的莖尖分化成苗最難，成苗率僅為5%～10%，莖尖培養(yǎng)30d后仍以形成疏松的愈傷組織為主，成苗所需時(shí)間相對(duì)其他馬鈴薯品種也最長(zhǎng)。近年來(lái)，王娟等［6］通過(guò)組織培養(yǎng)研究了不同莖尖大小、不同濃度和配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)脫毒效果的影響；于仙萍等［7］研究了采用不同處理方法對(duì)N88和D575馬鈴薯莖尖分化成苗率的影響；蔣瑜等［8］篩選了B13－6馬鈴薯莖尖脫毒的最佳培養(yǎng)基及影響因素；Aleksandar等［9］、Mutasim 等［10］分別研究了馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選及脫毒過(guò)程。但是，國(guó)內(nèi)外關(guān)于‘夏波蒂’馬鈴薯離體再生成苗的文獻(xiàn)報(bào)道較少［11－13］，未見(jiàn)‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗及病毒檢測(cè)的報(bào)道。本研究針對(duì)‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗率低，以熱處理結(jié)合莖尖剝離脫除病毒和類(lèi)病毒為目標(biāo)，篩選莖尖分化成苗最適宜的培養(yǎng)基，并通過(guò)RT－PCR 方法檢測(cè)再生苗病毒和類(lèi)病毒的脫毒率，為脫毒苗擴(kuò)繁和種薯繁育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材 料

采集田間疑似帶毒馬鈴薯植株的塊莖，低溫休眠后，室溫暗處催芽，消毒后接種在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選成活苗擴(kuò)繁，從而建立馬鈴薯無(wú)菌苗體系。用RT－PCR 方法檢測(cè)并篩選分別含有3 種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類(lèi)病毒（PSTVd）的2種材料，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上PVX、PVY、PLRV 的CP基因序列和PSTVd 全基因組序列，利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)4對(duì)特異引物（表1）。

1．2 方 法

1．2．1 熱處理 取生長(zhǎng)至高約1～2cm 的馬鈴薯無(wú)菌苗，在植物培養(yǎng)箱內(nèi)升溫1℃／d馴化20d左右，然后38℃／4h、22℃／12h光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 000lx，18℃／8h暗培養(yǎng)，變溫?zé)崽幚?周以鈍化病毒。

表1 RT－PCR檢測(cè)所用引物Table 1 The primer pairs for detection

1．2．2 培養(yǎng)基組成 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，組成24種培養(yǎng)基（表2），蔗糖30g／L，卡拉膠5g／L，pH 5．8。培養(yǎng)基及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑所含藥品，均購(gòu)自北京康貝斯生物科技有限公司。

表2 不同激素組合的培養(yǎng)基Table 2 The culture media with different hormone combinations

1．2．3 莖尖剝離與接種 剪取熱處理后長(zhǎng)勢(shì)較好的無(wú)菌苗（部分?jǐn)U繁無(wú)菌苗因耐熱差而長(zhǎng)勢(shì)弱或死亡），以注射器針代替解剖針，在40倍體視顯微鏡下進(jìn)行莖尖剝離。因剝離莖尖越大，成活率越高，但脫毒率低，為提高再生苗的脫毒率，試驗(yàn)全部剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖，莖尖大小約0．1～0．2 mm，壯苗莖尖稍大，弱細(xì)苗莖尖稍小。培養(yǎng)溫度為22℃，光照時(shí)間為16h／d，光照強(qiáng)度為3 000lx。

為降低污染率，每試管只接種1個(gè)莖尖，每處理培養(yǎng)基接種80個(gè)莖尖。10d后觀(guān)察并記錄莖尖生長(zhǎng)情況，30d后統(tǒng)計(jì)莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率和分化成苗率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）＝形成愈傷組織數(shù)／接種莖尖個(gè)數(shù)×100%

分化成苗率（%）＝分化成苗數(shù)／接種莖尖個(gè)數(shù)×100%

1．2．4 RT－PCR 檢測(cè) 為檢測(cè)馬鈴薯莖尖剝離再生苗病毒和類(lèi)病毒的脫除情況，隨機(jī)挑選熱處理前攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）且莖尖剝離分化后長(zhǎng)勢(shì)良好的再生苗36株，同時(shí)挑選熱處理前攜帶類(lèi)病毒（PSTVd）且莖尖剝離分化后長(zhǎng)勢(shì)良好的再生苗24株，擴(kuò)繁2 代后分別以RT－PCR 法進(jìn)行病毒檢測(cè)。

Trizol法提取馬鈴薯再生苗葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 分別擴(kuò)增不同病毒和類(lèi)病毒的目的基因片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。病毒檢測(cè)的Trizol試劑購(gòu)自invitrigen 公司，cDNA 合成試劑盒、TaqDNA聚合 酶、dNTP、瓊脂糖等購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

PCR 反應(yīng)體系包含模板DNA 3μL，正向（F）引物1μL，反向（R）引物1μL，10×PCR buffer 5 μL，2．5mmol／L dNTPs 4μL，TaqDNA 聚合酶1 μL，加ddH2O 至50μL。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，PVX、PSTVd 50℃（PVY、PLRV 59℃）退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

預(yù)期PVX、PVY、PLRV 的CP基因序列和PSTVd全基因組序列的擴(kuò)增片段大小分別為620、400、336和251bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用滅菌TE（pH 8．0）稀釋至濃度為10 μmol／L。

2 結(jié)果與分析

2．1 6－BA 與NAA 及IAA 激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響

在細(xì)胞分裂素6－BA 和生長(zhǎng)素NAA 的組合中（圖1），處理BN06的莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為78．75%，分化成苗率最高，為11．25%；BN01 莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)92．5%，但分化成苗率最低，僅6．25%。當(dāng)NAA 和GA3濃度一定時(shí)，6－BA濃度（1．0～5．0 mg／L）與莖尖分化成苗成正相關(guān)，而與愈傷組織誘導(dǎo)成負(fù)相關(guān)；當(dāng)6－BA 和NAA 濃度一定時(shí)，低濃度（0．2mg／L）、較高濃度（2．0mg／L）GA3能提高愈傷組織誘導(dǎo)率，而分化成苗率則降低。

在6－BA 與IAA 組合的培養(yǎng)基中（圖2），處理BI06莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為71．25%，而分化成苗率最高，為15%；BI01莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為80．0%，而分化成苗率則較低，僅7．5%。從圖1、2中發(fā)現(xiàn)，在NAA／IAA和GA3濃度一定時(shí)，6－BA 濃度（1．0～5．0mg／L）與莖尖分化成苗成正相關(guān)，而與愈傷組織的誘導(dǎo)成負(fù)相關(guān)；在6－BA 和GA3濃度一定時(shí)，IAA（0．5 mg／L）較NAA（0．2 mg／L）組合的培養(yǎng)基，莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)率降低，分化成苗率則提高。

圖1 6－BA 與NAA 激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．1 The influence of potato meristem differentiation seedling by 6－BA and NAA hormone combinations

圖2 6－BA 與IAA 激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．2 The influence of potato meristem differentiation seedling by 6－BA and IAA hormone combinations

2．2 ZT與NAA 及IAA激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響

在ZT 與NAA 組合的培養(yǎng)基中（圖3），莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高是ZN01處理，最低是ZN06，分別為77．5%和70．0%，二者差異不明顯；ZN04培養(yǎng)基的莖尖分化成苗率最高，為26．25%，ZN03分化成苗率最低，為12．5%。從圖3可以看出，當(dāng)NAA和GA3濃度一定時(shí)，ZT 濃度（1．0～5．0 mg／L）與愈傷組織的誘導(dǎo)、莖尖分化成苗均成負(fù)相關(guān)，這與圖1、2中6－BA 濃度（1．0～5．0mg／L）的作用明顯不同。表明ZT 濃度太高會(huì)影響莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)和莖尖分化成苗。在ZT 和NAA 濃度一定時(shí)，高濃度（2．0mg／L）、較低濃度（0．2 mg／L）GA3的作用明顯，能顯著提高莖尖分化成苗率。

圖3 ZT 與NAA 激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．3 The influence of potato meristem differentiation seedling by ZT and NAA hormone combinations

圖4 ZT 與IAA 激素組合對(duì)馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．4 The influence of potato meristem differentiation seedling by ZT and IAA hormone combinations

在ZT 與IAA 組合的培養(yǎng)基中（圖4），處 理ZI 03莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化成苗率均最低，分別為61．25%、5%；處理ZI04的莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率和分化成苗率均最高，分別為76．25%、23．75%。在IAA 和GA3濃度一定時(shí)，ZT 濃度（1．0～5．0mg／L）表現(xiàn)出與圖3中類(lèi)似的作用，即與愈傷組織的誘導(dǎo)、莖尖分化成苗均成負(fù)相關(guān)。高濃度（2．0mg／L）GA3與前3種組合（圖1～3）的作用相同，均能促進(jìn)莖尖分化成苗率，表明GA3（2．0 mg／L）是促進(jìn)‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗較為合適的濃度。由圖3 和圖4 比較后發(fā)現(xiàn)，在ZT 和GA3的濃度一定時(shí)，雖然IAA（0．5mg／L）較NAA（0．2mg／L）能抑制愈傷組織的誘導(dǎo)，但并沒(méi)有提高莖尖分化成苗率，反而略有下降，表明ZT 與NAA組合比ZT 與IAA 組合的莖尖分化成苗效果好。

由圖1～3中6－BA 與ZT 對(duì)‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗率的比較后發(fā)現(xiàn)，ZT 較6－BA 對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)不利，但更有利于莖尖分化成苗。ZN04培養(yǎng)基的分化成苗率是26．25%（圖3），ZI04 培養(yǎng)基的分化成苗率是23．75%（圖4），而B(niǎo)N04培養(yǎng)基的分化成苗率是7．5%（圖1），BI04 培養(yǎng)基的分化成苗率是10%（圖2），6－BA 與ZT 的作用差異明顯。所以，在本試驗(yàn)4類(lèi)組合的24種培養(yǎng)基中，最適合‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基是處理ZN04，即MS＋ZT1．0 mg／L＋NAA 0．2 mg／L＋GA32．0mg／L。

2．3 馬鈴薯莖尖分化成苗過(guò)程

在4類(lèi)組合24種培養(yǎng)基中，從莖尖分化成苗過(guò)程來(lái)看，10d后即能誘導(dǎo)形成淺綠色、米粒大小的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織逐漸增大，30～40d達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，以后逐漸開(kāi)始分化芽和根，55～70d時(shí)可生長(zhǎng)為完整的馬鈴薯再生苗，但不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的再生苗的生長(zhǎng)勢(shì)不同，其中，ZN04（圖5，a）和ZI04（圖5，b）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的再生苗葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)，莖干生長(zhǎng)健壯，二者均為正常組培苗；而B(niǎo)N03（圖5，c）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的再生苗盡管葉色正常，但葉片腫脹下垂，形成根系也少，BI03再生苗（圖5，d）沒(méi)有形成根系，葉色失綠，愈傷組織偏大，二者均為弱化組培苗。與其他馬鈴薯品種相比，‘夏波蒂’馬鈴薯開(kāi)始分化成苗和形成完整再生苗的時(shí)間均晚15～20d。

2．4 馬鈴薯再生苗病毒和類(lèi)病毒的RT－PCR檢測(cè)

凝膠成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT－PCR 電泳條帶差異明顯（圖6），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出不同病毒和類(lèi)病毒的目的條帶；3、5、7泳道和9泳道沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，表明被檢測(cè)再生苗分別不含病毒PVX、PVY、PLRV 和類(lèi)病毒PSTVd；部分再生苗的RTPCR 產(chǎn)物檢測(cè)出目的條帶，表明未脫除相應(yīng)的病毒或類(lèi)病毒。

圖5 不同激素組合培養(yǎng)基中的莖尖分化再生苗Fig．5 The differentiation seedling of potato by different hormone combinations

圖6 馬鈴薯病毒和類(lèi)病毒的RT－PCR檢測(cè)Fig．6 The RT－PCR detection of potato virus and viroid

表3 再生苗病毒和類(lèi)病毒的檢測(cè)結(jié)果Table 3 The detecting result of viruses and viroid of regenerated plantlets

再生苗3種病毒PVX、PVY 和PLRV 的檢測(cè)結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)：36 株全部不攜帶PLRV，33株不攜帶PVY，25株不攜帶PVX。3株攜帶PVY 的再生苗同時(shí)攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y 病毒次之，卷葉病毒容易脫除，且3 種病毒PVX、PVY 和PLRV 的脫毒率分別為69．4%、91．7%和100%。

再生苗類(lèi)病毒PSTVd的檢測(cè)結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)：莖尖剝離脫毒后，24株再生苗中僅有2株脫除了類(lèi)病毒，脫毒率僅為8．3%，表明熱處理結(jié)合莖尖剝離脫毒法也很難脫除PSTVd。對(duì)再生苗中未脫除PSTVd的22株再生苗進(jìn)行二次莖尖剝離，成苗后經(jīng)過(guò)RT－PCR檢測(cè)，又有3株脫除了PSTVd，二次脫毒率升高為20．8%，表明通過(guò)二次莖尖剝離可以提高PSTVd的脫毒率。

3 討 論

熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的馬鈴薯脫毒技術(shù)，能有效脫除危害馬鈴薯生長(zhǎng)的常見(jiàn)病毒和類(lèi)病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM 和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對(duì)一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX 較難脫除，PLRV 容易脫除，本研究的試驗(yàn)結(jié)果和國(guó)外一些學(xué)者［14－16］研究的結(jié)論是一致的。對(duì)于PVS、PVX 等較難脫除的病毒，主要采用是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法。而脫除PSTVd目前仍沒(méi)有理想的方法，主要以篩選田間抗類(lèi)病毒植株的塊莖為主。本試驗(yàn)以二次莖尖剝離法脫除類(lèi)病毒，提高了類(lèi)病毒的脫毒率。并在檢測(cè)無(wú)體細(xì)胞變異的情況下，嘗試以多次莖尖剝離法來(lái)提高類(lèi)病毒的脫毒效果。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在脫除病毒或類(lèi)病毒的過(guò)程中，提高無(wú)菌試管苗擴(kuò)繁時(shí)的環(huán)境溫度到25～27℃，有利于提高試管苗的生長(zhǎng)速度，快速剝?nèi)∩L(zhǎng)旺盛的莖尖分生組織，能一定程度提高脫毒率。

莖尖組織培養(yǎng)法是剝離莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒有直接關(guān)系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗(yàn)為獲得脫毒效果更好的再生苗，以帶1個(gè)葉原基的莖尖為剝離對(duì)象，同時(shí)相對(duì)降低了莖尖分化成苗率，與國(guó)內(nèi)多數(shù)學(xué)者剝離帶1～2或2～3個(gè)葉原基的試驗(yàn)區(qū)別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性的不同，需要不同的培養(yǎng)基環(huán)境。不同濃度激素的篩選及濃度配比尤為重要，按一定濃度激素配比來(lái)促進(jìn)馬鈴薯莖尖分生組織愈傷組織的誘導(dǎo)和分化成苗。本試驗(yàn)中的ZT 與6－BA 相比，能明顯提高‘夏波蒂’馬鈴薯的莖尖分化成苗率；高濃度的GA3也能提高莖尖分化成苗率。試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZT 的濃度為1．0mg／L，NAA 的濃度為0．2mg／L 與IAA 的濃度為0．5 mg／L 時(shí)，莖尖分化成苗率差異不大，所以，在ZT 和GA3濃度一定時(shí)，有待進(jìn)一步試驗(yàn)降低NAA 或者提高IAA 的濃度，可能會(huì)篩選出莖尖分化成苗率更高的培養(yǎng)基。

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