過表達IbOr基因甘薯增強抗旱性的生理機制

陳曉麗，李紅兵，王林林，李孟潔，李雨霖，郭尚洙，鄧西平＊

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100；2 中國科學(xué)院水利部水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，陜西楊陵712100；3 韓國生命工學(xué)研究院，韓國大田）

正常條件下，植物細胞中產(chǎn)生的活性氧與其清除系統(tǒng)保持平衡，而當環(huán)境脅迫長期作用于植株，產(chǎn)生的活性氧超出了活性氧清除系統(tǒng)的能力時，就會引起活性氧累積產(chǎn)生氧化傷害，從而使細胞功能失常，機體出現(xiàn)各種自由基綜合癥。植物體在長期進化過程中也相應(yīng)地形成了酶促和非酶促兩大類保護系統(tǒng)，酶促保護系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等，非酶促系統(tǒng)主要包括一些抗氧化劑如抗壞血酸（Vc）、類胡蘿卜素（Car）、花青素（Anthocyanins）和谷胱甘肽（GSH）等，它們的協(xié)調(diào)作用賦予植物體以清除活性氧的能力，減輕或避免活性氧對細胞造成傷害，從而表現(xiàn)出對氧化脅迫的抗性。

甘薯富含次生代謝產(chǎn)物，尤其是抗氧化化合物包括花青素、類胡蘿卜素和維生素C［1］。橙色薯肉甘薯品種富含類胡蘿卜素。類胡蘿卜素在高等植物中參與光合作用，一方面阻止激發(fā)態(tài)葉綠素分子的激發(fā)能從反應(yīng)中心向外傳遞；另一方面，它也保護葉綠素分子免遭光氧化損傷。另外，類胡蘿卜素作為ABA 合成的前體，也是人類飲食中維生素A 的主要來源［2］。橙色基因（orange，Or）的發(fā)現(xiàn)提供了改良作物類胡蘿卜素含量的新手段，Or基因是在菜頭呈橘黃色的花椰菜中發(fā)現(xiàn)的天然半顯性突變，能使原本不積累類胡蘿卜素的組織如菜頭、莖髓、葉子基部等大量積累類胡蘿卜素［3－4］。Or基因編碼一個定位于質(zhì)體富含半胱氨酸的Dna J類似蛋白。正如花椰菜的Or蛋白質(zhì)—熱休克蛋白（HSP），作為分子伴侶可調(diào)控質(zhì)粒。例如，番茄HSP21可保護光合體系Ⅱ免受氧化脅迫，促進葉綠體轉(zhuǎn)換成有色體，進而導(dǎo)致類胡蘿卜素積累［5］。從橙肉甘薯分離的橙色基因（IbOr）通過提高類胡蘿卜素生物合成基因的表達水平來增加類胡蘿卜素的積累［6］。轉(zhuǎn)Or基因的土豆塊莖和擬南芥花序都表現(xiàn)出類胡蘿卜素含量升高的現(xiàn)象，說明Or基因在改良作物的類胡蘿卜素含量方面具有廣泛的應(yīng)用前景［7］。

甘薯是中國主要的農(nóng)作物之一，已有許多文獻指出水分脅迫下甘薯的旱害與氧化脅迫有關(guān)［8－10］。干旱脅迫能誘導(dǎo)過量活性氧的產(chǎn)生［11］，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧積累，從而對植物的細胞結(jié)構(gòu)和生理代謝產(chǎn)生嚴重的危害，進而使植物遭受生理損害。本實驗通過室內(nèi)水培實驗檢驗PEG－6000模擬的干旱脅迫下，過表達IbOr基因甘薯是否通過提高自己的抗氧化能力來增強其對干旱脅迫的抗性。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

供試材料紫肉甘薯SZM 及過表達IbOr基因的2個轉(zhuǎn)基因株系（Or207，Or210）由韓國生命工學(xué)研究院提供，其中轉(zhuǎn)基因株系由包含花椰菜花葉病毒35S啟動子的pGWB11植物表達載體構(gòu)建得到pGWB11－IbOr，進而轉(zhuǎn)化SZM 獲得。從盆栽植株中剪取五葉一心苗移入1／2Hoagland溶液中，散射光照強度為200μmol·m－2·s－1，室溫為20～30℃，室內(nèi)水培15～20d。

1．2 水分脅迫處理

參照張明生等［9］的實驗結(jié)果，將水培15～20d的培養(yǎng)苗轉(zhuǎn)入含15%聚乙二醇（PEG－6000）的1／2 Hoagland培養(yǎng)液中進行輕度水分脅迫處理，溶液水勢（ψWw）約為－0．44 MPa，分別于脅迫3、6、24、48和72h 后取樣測定各項指標。對照材料用不含PEG－6000的1／2Hoagland溶液培養(yǎng)。

1．3 測定指標及方法

1．3．1 葉綠素含量 葉綠素含量的測定采用丙酮提取方法。稱取甘薯葉片鮮樣約0．2g，置于研缽中用液氮迅速研磨成粉狀，用5 mL 80%丙酮分3次（2、2和1mL）沖洗研缽使粉末充分浸泡于丙酮中，避光4℃放置2h，每0．5h振蕩1次。2h后將丙酮提取液于4 000×g離心20min，取上清液，稀釋4倍后分別測定470、663、646nm 3 個波長下的吸光值OD470、OD663和OD646，據(jù)此計算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）、葉綠素（CT）和類胡蘿卜素（Cx．c）的含量，公式如下：

1．3．2 光合指標 凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度的測定使用美國Li－COR 公司生產(chǎn)的Li－6400氣體交換光合測定系統(tǒng)，采用開放式氣路，測定條件為（28±2）℃，空氣CO2濃度（500±10）μmol·m－2·s－1，光照強度（500±1）μmol·m－2·s－1。

1．3．4 丙二醛含量 丙二醛（MDA）含量測定按照趙世杰等［14］的方法。

1．3．5 抗氧化酶活性 SOD 和POD 活性的測定參照高俊風(fēng)［15］編寫的實驗指導(dǎo)書。

以上各生化指標均用倒3、倒4 葉混合樣進行測定，每個處理重復(fù)3次，光合作用參數(shù)每個處理測定3個不同的葉片。實驗結(jié)果取3 次測定的平均值，表示為平均值±標準差。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

差異顯著性分析采用SPSS 16．0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2．1 水分脅迫對甘薯幼苗光合色素含量的影響

在受到干旱脅迫時，植物葉綠體受損，葉綠素含量降低，從而影響到光合作用效率。如圖1所示，轉(zhuǎn)基因甘薯（Or207和Or210）和非轉(zhuǎn)基因甘薯（SZM）幼苗葉片葉綠素a含量在15%PEG－6000處理下均開始下降，并在脅迫24h后二者無顯著差異；隨脅迫時間增加，非轉(zhuǎn)基因甘薯和轉(zhuǎn)基因甘薯株系Or210葉綠素a含量持續(xù)降低，而另一株系Or207反而略有增加，但仍始終低于脅迫前（CK）水平；在干旱脅迫48和72h后，轉(zhuǎn)基因甘薯葉綠素a含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，Or207 株系又顯著高于Or210株系（圖1，A）。同時，在水分脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片葉綠素b含量隨脅迫時間的變化趨勢與葉綠素a的表現(xiàn)大致相同（圖1，B）。另外，在正常供水條件下，2個轉(zhuǎn)基因甘薯株系類胡蘿卜素含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯。水分脅迫24h后，轉(zhuǎn)基因株系類胡蘿卜素含量下降，非轉(zhuǎn)基因甘薯類胡蘿卜素含量略有上升，二者含量幾乎相等；隨脅迫時間增加，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因甘薯類胡蘿卜素含量都有所下降，然而轉(zhuǎn)基因株系的類胡蘿卜素含量仍顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，Or207株系又顯著高于Or210株系（圖1，C）。以上結(jié)果說明在水分脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗光合色素含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，從而提高其光合作用效率。

2．2 水分脅迫對甘薯幼苗葉片凈光合速率及有關(guān)參數(shù)的影響

圖2顯示，各類甘薯幼苗葉片凈光合速率（Pn）在水分脅迫24h后均明顯下降，但進一步延長脅迫時間，轉(zhuǎn)基因甘薯Pn小幅降低，非轉(zhuǎn)基因甘薯Pn反而稍有增加，但仍低于轉(zhuǎn)基因甘薯Pn（圖2，A）；各類甘薯幼苗葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）在水分脅迫后同樣大幅下降，然后趨于穩(wěn)定，在脅迫24和48h后，轉(zhuǎn)基因甘薯Gs仍高于非轉(zhuǎn)基因甘薯（圖2，B）；同時，轉(zhuǎn)基因甘薯葉片蒸騰速率（Tr）在無水分脅迫時顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，在水分脅迫條件下，各類甘薯Tr均明顯大幅度降低，但轉(zhuǎn)基因株系蒸騰速率仍顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株（圖2，D）。另外，與以上指標變化類似，各類甘薯株系幼苗胞間CO2濃度（Ci）在受到水分脅迫后也均明顯降低，但轉(zhuǎn)基因株系Ci顯著低于非轉(zhuǎn)基因甘薯（圖2，C）。以上結(jié)果說明在水分脅迫條件下，各類甘薯幼苗的光合作用均受到抑制，但轉(zhuǎn)基因甘薯的抑制程度低于非轉(zhuǎn)基因甘薯。

2．3 水分脅迫對甘薯葉片和MDA 含量的影響

圖1 水分脅迫下甘薯幼苗葉片光合色素含量的變化Fig．1 The photosynthetic pigment contents in leaves of sweet potato seedling under water deficit

O2接受一個電子后形成，是活性氧自由基的一種，是所有氧自由基的前身，其大量積累會對細胞產(chǎn)生氧化傷害，使生物體生物膜的結(jié)構(gòu)及功能受到損傷，引起核酸和蛋白質(zhì)變性等，從而對細胞及組織產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。由圖3，A 可見，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片含量均隨水分脅迫時間的增加而不斷提高，但脅迫后不同時間轉(zhuǎn)基因甘薯含量均低于非轉(zhuǎn)基因甘薯，尤其是脅迫24 h后，轉(zhuǎn)基因甘薯含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因甘薯，表明轉(zhuǎn)基因株系積累了較少的活性氧自由基前身。

同時，丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量反映植物細胞受環(huán)境脅迫等傷害的程度。由圖3，B 可知，各類甘薯幼苗葉片中MDA 含量在水分脅迫后均隨脅迫時間的延長而不斷增加，表明植株受傷害的程度不斷加深；然而，相比于非轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株在正常供水和水分脅迫后均保持了較低的MDA含量，如脅迫4 8h后，非轉(zhuǎn)基因甘薯株系MDA 含量約為轉(zhuǎn)基因甘薯株系的1．5倍。這說明轉(zhuǎn)基因甘薯對水分脅迫的適應(yīng)性較強，受活性氧攻擊的損傷較輕。

2．4 水分脅迫對甘薯幼苗葉片SOD 和POD 活性的影響

圖2 水分脅迫下甘薯幼苗葉片光合參數(shù)的變化Fig．2 The photosynthetic parameters in leaves of sweet potato seedling under water deficit condition

圖3 水分脅迫下甘薯幼苗葉片和MDA 含量的變化Fig．3 The superoxide anion and malondialdehyde content in leaves of sweet potato seedling under water deficit condition

圖4 水分脅迫下甘薯幼苗葉片SOD 和POD 活性的變化Fig．4 The SOD and POD activities in leaves of sweet potato seedling under water deficit condition

抗氧化酶系統(tǒng)極易受到環(huán)境脅迫的影響，同時也是反映植物對環(huán)境脅迫耐受程度的重要指標。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是抵御活性氧傷害的第一道防線，它可以將歧化為H2O2。而過氧化物酶（POD）可在逆境或衰老初期表達，清除H2O2。POD 廣泛存在于植物體內(nèi)不同組織中，它作為活性較高的適應(yīng)性酶，能夠反映植物生長發(fā)育的特點、體內(nèi)代謝狀況以及對外界環(huán)境的適應(yīng)性。圖4，A 表明，在正常水分條件下，轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片SOD活性稍高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，但差異不明顯；PEG 模擬干旱脅迫24h后，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片SOD 活性均升高，脅迫48h 后，甘薯幼苗葉片SOD 活性達到最高，但轉(zhuǎn)基因甘薯株系SOD 活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯；隨著脅迫時間的延長，SOD活性均有所降低，但轉(zhuǎn)基因甘薯株系幼苗SOD 活性降低幅度較小，仍顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯。同時，在正常水分條件下，轉(zhuǎn)基因甘薯與非轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片POD 活性無顯著差別，但在水分脅迫24h后，轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗POD 活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，特別是轉(zhuǎn)基因甘薯株系Or207在脅迫后POD 活性約為脅迫前的2．5倍；與SOD 活性變化趨勢相似，脅迫48h后，甘薯幼苗POD 活性達到最大；脅迫72 h后，POD 活性均有所降低，但仍高于脅迫前水平（圖4，B）。這說明水分脅迫可以誘導(dǎo)甘薯幼苗葉片SOD 和POD 活性提高，相比于非轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因株系幼苗酶活性的增強更明顯，從而使得轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗具有更強的抗氧化能力。

3 討 論

作物葉綠素含量的高低是反映其光合能力的重要指標之一，葉綠素的含量往往直接影響著光合作用的速率和光合產(chǎn)物的形成，最終影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的提高［16－17］。通常情況下，水分脅迫會對植物的葉綠體造成一定的損傷，降低葉片中葉綠素的含量，從而降低植物的光合速率，導(dǎo)致光合功能迅速衰退。本實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因甘薯葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量在水分脅迫后明顯下降，但轉(zhuǎn)基因株系的含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，表明水分脅迫對轉(zhuǎn)基因株系光合能力的損傷要小于非轉(zhuǎn)基因甘薯?？梢?，過表達IbOr基因增強了甘薯對水分脅迫的耐受能力，其可能通過保持較高的葉綠素和類胡蘿卜素水平，延緩葉片光合功能來實現(xiàn)。同時，在水分脅迫條件下，甘薯葉片Pn、Gs、Ci和Tr也都明顯下降，但轉(zhuǎn)基因株系的Pn、Gs和Tr都高于非轉(zhuǎn)基因甘薯，表明在水分脅迫條件下轉(zhuǎn)基因甘薯由于具有較高的葉綠素和類胡蘿卜素含量及氣孔導(dǎo)度，因而保持了高于非轉(zhuǎn)基因甘薯的光合和蒸騰能力，反映了在干旱條件下由于轉(zhuǎn)基因甘薯具有生理代謝上的優(yōu)勢，因此對干旱表現(xiàn)出了較強的耐性。在水分脅迫后，非轉(zhuǎn)基因甘薯保持了較高的胞間CO2濃度（Ci），這可能由于非轉(zhuǎn)基因甘薯葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低，光合能力嚴重受損，胞間CO2無法及時消耗，因而累積造成。

在水分脅迫條件下，植物細胞內(nèi)活性氧大量積累，誘發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，對細胞造成不可逆的傷害，甚至引起細胞死亡［21］。本實驗發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因甘薯葉片中MDA 含量在脅迫后各時間點都顯著高于轉(zhuǎn)基因植株，說明其受到的傷害大，而轉(zhuǎn)基因植株受到的氧化傷害相對較小。這是由于轉(zhuǎn)基因植株具有較低水平的含量，加之轉(zhuǎn)基因株系由于具有較高的SOD 和POD 活性，保持了較低水平的活性氧，從而受到的氧化傷害要小一些。另外，類胡蘿卜素派生物ABA 可以作為植物非生物脅迫信號，通過類胡蘿卜素抗氧化活性和ABA 增加的協(xié)調(diào)作用，參與多種脅迫反應(yīng)，提高轉(zhuǎn)基因甘薯的抗氧化能力［20］。因此，轉(zhuǎn)基因甘薯增強了對水分脅迫的耐受能力主要是通過抗氧化能力的提高來實現(xiàn)的。

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