巴西橡膠樹(shù)HbMKK 4基因的克隆及表達(dá)分析

吳紹華，張世鑫，2，楊署光，田維敏＊

（1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地－海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州571737；2 海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，?？?70228）

橡膠作為世界四大工業(yè)原材料之一，是一種重要的戰(zhàn)略物資。目前，99%以上的天然橡膠來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)（Heveabrasiliensis）。巴西橡膠樹(shù)原產(chǎn)于高溫、高濕、靜風(fēng)的巴西亞馬遜河流域，是典型的熱帶雨林樹(shù)種。中國(guó)種植橡膠樹(shù)的區(qū)域主要位于N 18°～24°的熱帶北緣地區(qū)（主要是海南、云南和廣東）。橡膠樹(shù)是一種異花授粉高度雜合的多年生木本經(jīng)濟(jì)作物，傳統(tǒng)的雜交育種周期長(zhǎng)，從人工授粉苗開(kāi)始到選出一個(gè)供生產(chǎn)上大規(guī)模推廣種植的品種一般需要30年時(shí)間。為了縮短育種年限，提高選種效率，減少土地、人力、物力的消耗，發(fā)展對(duì)雜交后代的早期篩選技術(shù)及從分子水平上改良橡膠樹(shù)品質(zhì)是行之有效的方法。由于對(duì)橡膠樹(shù)產(chǎn)量調(diào)控分子機(jī)理缺乏足夠的了解，在分子標(biāo)記輔助育種及轉(zhuǎn)基因改良橡膠樹(shù)品質(zhì)上難以取得突破，限制了橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的進(jìn)程。因此，天然橡膠生物合成調(diào)控分子機(jī)理的研究就顯得迫切而重要。早在2000年，郝秉中等［1］研究證明茉莉酸類物質(zhì)（jasmonates，JA）是調(diào)節(jié)巴西橡膠樹(shù)乳管分化的關(guān)鍵信號(hào)分子。外施JA可顯著上調(diào)橡膠生物合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，并能提高膠乳的干膠含量［2］。據(jù)此，推測(cè)天然橡膠的生物合成可能受茉莉酸信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)。但到目前為止，對(duì)于JA 如何調(diào)控天然橡膠生物合成的機(jī)理了解的較少。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)途徑是真核生物中保守的信號(hào)途徑，由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶（MAPK kinase，MAPKK／MKK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶（MAPK kinase kinase，MAPKKK）3個(gè)組分組成［3］，由MAPKKK－MAPKK－MAPK 依次磷酸化傳遞信號(hào)［4－5］。有研究表明，MAPK 級(jí)聯(lián)途徑與JA 信號(hào)途徑具有交互作用，在植物發(fā)育及防御應(yīng)答中起著重要的作用［6－11］。因此，本研究從巴西橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中克隆了MAPK 級(jí)聯(lián)途徑組分中的MKK 家族成員HbMKK4 的全長(zhǎng)cDNA，并分析了其在橡膠樹(shù)不同組織中的表達(dá)特性及其在割膠及茉莉酸甲酯和乙烯利處理下的表達(dá)特點(diǎn)，以期了解其在橡膠生物合成中的功能，為進(jìn)一步研究MAPK 級(jí)聯(lián)途徑如何通過(guò)JA 信號(hào)途徑調(diào)控橡膠的生物合成打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料與處理

實(shí)驗(yàn)材料為種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)的‘熱研7－33－97（CATAS 7－33－97）’橡膠樹(shù)實(shí)生苗、一年生萌條和割齡為3年的開(kāi)割樹(shù)?！疅嵫?－33－97’實(shí)生苗用于分析基因表達(dá)的組織特異性，選生長(zhǎng)狀態(tài)相近的根、樹(shù)皮、膠乳、葉片，液氮凍存用于RNA 提取。割膠處理采用割齡為3年的開(kāi)割樹(shù)，選樹(shù)圍一致，割線離地高度一致的‘熱研7－33－97’開(kāi)割樹(shù)進(jìn)行割膠處理、割線為1／2樹(shù)圍螺旋割線，第一刀采集的膠乳作為對(duì)照，然后分別在第一刀割膠處理后的0．5h、2h、6h、12h、14h、1d、2d和3d割第二刀，采集的膠乳作為處理樣品，每時(shí)間點(diǎn)采集5棵樹(shù)，5棵樹(shù)的cDNA 等量混合用于基因表達(dá)分析。乙烯利（ethephon，ET）及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理采用的是1年生萌條，選大小及生理狀態(tài)相近、葉篷穩(wěn)定的‘熱研7－33－97’的萌條為材料，用0．07% MeJA 涂抹第三伸長(zhǎng)單位的節(jié)間樹(shù)皮，作為處理組，對(duì)照為用于溶解0．07% MeJA的水劑；另外，用含0．5% ET 的溶液涂抹第三伸長(zhǎng)單位節(jié)間樹(shù)皮，作為乙烯利處理組，對(duì)照為用于溶解0．5%ET 的水劑。分別于處理后的1h、2h、4h、8 h、1d、2d、3d和5d用刀片割開(kāi)樹(shù)皮，每時(shí)間點(diǎn)處理9根萌條，將混合膠乳采集于RNA 提取液中。

1．2 方 法

1．2．1 總RNA 提取與cDNA 合成 橡膠樹(shù)的根、樹(shù)皮、葉片、膠乳RNA 的提取均參照天根公司RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，柱上消化RNA 樣品中殘留的微量DNA。cDNA 第一鏈合成參照Ferments公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．2HbMKK4基因的RACE 擴(kuò)增和全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增 從巴西橡膠樹(shù)膠乳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一段MKK 的Unigene序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)RACE 引物，采 用Clontech 公司的試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit進(jìn)行序列的RACE擴(kuò)增。其中5′－RACE 引物為5－GSP1（5′－TAAGTTCCGTTTCCTGGTCTTGTTTC－3′）和5－GSP2（5′－ATGACTCCGATGCGATAAGATTTGA－3′）；3′－RACE引物為3－GSP1（5′－CTTGGGGGTGAGCATATTGGAGTTCT－3′）和3－GSP2（5′－ATCAAGGAATAGTGGAGGCCAAAGAG－3′）。以RACE 測(cè)序片段與Unigene序列拼接的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增引物FL－CDNA－F（5′－CGCTTTTCTCTCACCTGCAAAG－3′）和FL－CDNA－R（5′－TGTTGAAACCAGGAGCATGAAC－3′）。全長(zhǎng)cDNA 擴(kuò)增體系：Takara PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，F(xiàn)L－CDNA－F（10μmol·L－1）2．5μL，F(xiàn)L－CDNA－R（10μmol·L－1）2．5μL，cDNA 模板1μL，滅菌水補(bǔ)足50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。0．8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，天根膠回收試劑盒純化目的條帶，克隆到全式金公司的pEASY－Blunt Simple Cloning Vector載體上，送Invitrogen公司測(cè)序。

1．2．3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站ORF Finder 軟件（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)，同時(shí)翻譯成蛋白序列。DNAMAN 軟件對(duì)基因的編碼氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析。用ProtParam 軟件（http：／／au．expasy．org／tools／protparam．html／）在線分析該蛋白的分子量與等電點(diǎn)。SOPMA 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。NetPhos 2．0Server在線預(yù)測(cè)氨基酸的磷酸化位點(diǎn)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同植物的MKK 蛋白序列，利用軟件MEGA 4．0采用Neighbor－Joining（NJ）模型，并進(jìn)行1 000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)構(gòu)建包括HbMKK4 蛋白序列在內(nèi)的植物MKK 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1．2．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 采用Bio－Rad公司的CFX 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行基因的相對(duì)定量表達(dá)分析。取1μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為實(shí)時(shí)定量PCR 分析的模板。HbMKK4熒光定量引物為MKK4－F（5′－TGTTGCTGTTGTTATTGTTGGTG－3′）和 MKK4－R（5′－ACCCCATTCCCCATTTCTTTCT－3′）。內(nèi) 參基因引物為Actin－F（5′－GATTCCGTTGCCCAGAAGTC－3′）和Actin－R（5′－CACCACTCAGCACAATGTTACC－3′）。20μL熒光定量反應(yīng)體系中，包含1μL cDNA 模板，10μL Takara 2×SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）和每條引物10μmol·L－1各0．6μL（引物終濃度為0．3μmol·L－1）。PCR 反應(yīng)程序 為：95℃預(yù)變性30s；95℃變 性10 s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。利用CFX manager 3．0軟件自動(dòng)進(jìn)行基線和Cq值分析。以HbActin作為內(nèi)參基因，采用2－△△Cq算法分析相對(duì)表達(dá)量。

采用t測(cè)驗(yàn)對(duì)處理與對(duì)照樣品的相對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 HbMKK 4基因全長(zhǎng)cDNA 的克隆及生物信息學(xué)分析

本研究通過(guò)5′－RACE 擴(kuò)增，獲得了305bp 非編碼區(qū)序列（untranslated region，UTR），通過(guò)3′－RACE獲得長(zhǎng)336bp 序列（圖1），將兩端序列與Unigene序列進(jìn)行拼接，并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA 引物，對(duì)拼接序列進(jìn)行RT－PCR 和測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示HbMKK4基因（GenBank 登錄號(hào)KP262501）全長(zhǎng)cDNA 序列1 580bp，其中5′－UTR 長(zhǎng)305bp，3′－UTR 長(zhǎng)216bp，ORF編碼框1 059bp，編碼352個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 HbMKK 4基因RACE及全長(zhǎng)cDNA（FL－cDNA）電泳結(jié)果Fig．1 The agarose gel electrophoresis of HbMKK 4 RACE and full－length cDNA（FL－cDNA）

圖2 橡膠樹(shù)HbMKK 4基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列Fig．2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HbMKK 4

圖3 HbMKK4推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物MKK 蛋白序列比對(duì)Fig．3 The deduced amino acid sequences of HbMKK4compared with other plant MKKs

保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白含有S＿TKc結(jié)構(gòu)域（Serine／Thresnine protein kinases，catalytic domine），具有激酶活性位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，屬于PKC超家族。在線軟件磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白共有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中9個(gè)絲氨酸（Ser－S）位點(diǎn)，4個(gè)蘇氨酸（Thr－T）位點(diǎn)，1 個(gè)酪氨酸（Tyr－Y）位點(diǎn)（圖3）。Prot－Param 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白分子式為C1700H2718N508O509S13，分子量為38．83kD，理論等電點(diǎn)為9．36，不穩(wěn)定系數(shù)為50．94，屬于不穩(wěn)定類蛋白。在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該氨基酸序列由30．11%α－螺旋、13．64%延伸鏈、4．26%β－轉(zhuǎn)角和51．99%無(wú)規(guī)則卷曲組成。另外，該蛋白無(wú)導(dǎo)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域、屬于親水性蛋白。

2．2 HbMKK 4 推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)橡膠樹(shù)HbMKK4 推導(dǎo)氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中部分MKK 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，該基因編碼氨基酸序列與其他物種MKK 氨基酸序列具有較高相似性，其中與麻瘋樹(shù)（Jatrophacurcas）假定蛋白JCGZ＿19828（KDP－27705．1）、毛果楊（Populustrichocarpa）PtMKK4（XP＿006379405．1）和蓖麻（Ricinuscommunis）Rc－MKK（XP＿002523019．1）的相似性分別為82．83%、73．63%和72．47%（圖3）。聚類結(jié)果顯示，橡膠樹(shù)HbMKK4氨基酸序列與麻瘋樹(shù)假定蛋白JCGZ＿19828（KDP27705．1）聚為一類，親緣關(guān)系最近（圖4）。

2．3 HbMKK 4基因表達(dá)分析

圖4 HbMKK4與其它物種MKK 蛋白的進(jìn)化分析Fig．4 Phylogenetic relationships between HbMKK4and other plant MKKs

圖5 HbMKK 4基因的組織特異性表達(dá)分析Fig．5 Transcription pattern analysis of HbMKK 4 in different tissues from Hevea brasiliensis

圖6 不同處理對(duì)膠乳HbMKK4基因表達(dá)的影響Fig．6 Expression patterns of HbMKK4under the different treatment

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，以HbActin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)了HbMKK4基因表達(dá)的組織特異性（圖5），及其在割膠、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯利（ET）處理下膠乳中的表達(dá)模式（圖6）。結(jié)果顯示，HbMKK4在橡膠樹(shù)的根、樹(shù)皮、膠乳及葉片中均有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)最高，樹(shù)皮及膠乳中的表達(dá)相近，淡綠期及成熟期葉片相對(duì)古銅期及變色期表達(dá)有所上升（圖5）。

割膠顯著上調(diào)膠乳中HbMKK4 基因的表達(dá)，基因相對(duì)表達(dá)量在割膠后2h達(dá)到最高，是對(duì)照的2倍多，達(dá)極顯著水平，在割膠處理6h～3d，基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)至對(duì)照水平。茉莉酸甲酯顯著上調(diào)HbMKK4基因的表達(dá)，MeJA 處理1h后，基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，在8h后達(dá)到最高，表達(dá)量是對(duì)照1．5倍多，1d后，表達(dá)量逐漸下調(diào)至對(duì)照水平。另外，ET 處理也能上調(diào)HbMKK4基因的表達(dá)，但是上調(diào)的幅度比割膠、MeJA 處理要小。ET 處理4 h后，基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，僅是對(duì)照的1．3倍。而且，ET 處理2d后，基因表達(dá)顯著下調(diào)，相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的0．7倍（圖6）。

3 討 論

植物MAPK 級(jí)聯(lián)途徑在植物的逆境脅迫及發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，植物的MKK4主要參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)及滲透脅迫。如擬 南 芥 中 MEKK1－MKK4／MKK5－MPK3／MPK6級(jí)聯(lián)途徑通過(guò)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子WRKY22、WRKY29 和FRK1（flg22－induced receptor kinase 1）的活性，參與擬南芥對(duì)細(xì)菌和真菌病原物的先天免 疫［12］。最近證實(shí)EDR1 通過(guò)負(fù)調(diào)控MKK4／MKK5－MPK3／MPK6級(jí)聯(lián)途徑參與植物的先天免疫［13］。另外，擬南芥MKK4通過(guò)調(diào)控MPK3活性參與滲透脅迫響應(yīng)［14］。

橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中的乳管是橡膠樹(shù)合成和儲(chǔ)存天然橡膠的場(chǎng)所，也是橡膠樹(shù)的一種防衛(wèi)結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含物膠乳是一種重要的防御應(yīng)答誘導(dǎo)的次生代謝產(chǎn)物［1］，含有大量的防衛(wèi)相關(guān)蛋白［15－17］。JA 是調(diào)節(jié)植物次生代謝的關(guān)鍵信號(hào)分子，植物防衛(wèi)反應(yīng)可以誘導(dǎo)體內(nèi)JA 的積累，JA 通過(guò)調(diào)控次生代謝生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成［18－20］。郝秉中等［1］發(fā)現(xiàn)外施JA 及其前體亞麻酸能夠誘導(dǎo)橡膠樹(shù)的次生乳管分化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷可以誘導(dǎo)乳管分化，其效應(yīng)可被外施JA 生物合成的抑制劑阻斷，表明機(jī)械傷害引起內(nèi)源JA 的合成和積累，進(jìn)而誘導(dǎo)乳管分化［21］。外施JA 也可顯著上調(diào)橡膠生物合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，并能提高膠乳的干膠含量［2］。因此，推測(cè)天然橡膠的生物合成可能受JA信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)。

蛋白激酶或蛋白磷酸化抑制劑的藥理學(xué)研究證實(shí)蛋白的磷酸化及去磷酸化在JA 信號(hào)途徑中起著重要的作用［22］。而且，MAPK 級(jí)聯(lián)途徑與JA 信號(hào)途徑具有交互作用，在植物發(fā)育及防御應(yīng)答中起著重要的作用［6－11］。Takahashi 等［8］揭 示 MKK3－MPK6組分在擬南芥茉莉酸信號(hào)中起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，受JA 誘導(dǎo)的MPK6活性在突變體mkk3－1植株中被抑制，而在35S－MKK3 植株中被增強(qiáng)，表明受JA 誘導(dǎo)的MPK6活性依賴于MKK3。同時(shí)，MAPK 級(jí)聯(lián)途徑也參與乙烯的應(yīng)答。擬南芥中MKK4／5－MPK3／6 通過(guò)調(diào)控乙烯合成限速酶ACS2／6參與乙烯的合成［23－24］。Yoo等［25］研究證實(shí)MKK9－MPK3／6也參與乙烯的應(yīng)答反應(yīng)。

本研究從乳管細(xì)胞中克隆了HbMKK4基因的全長(zhǎng)cDNA，并分析了其在割膠、MeJA、ET 處理下的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)HbMKK4基因的表達(dá)受割膠、MeJA、ET 誘導(dǎo)。目前，割膠是天然橡膠生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一，而且能夠促進(jìn)乳管分化［26］，也促進(jìn)天然橡膠生物合成［27］。乙烯利是一種人工合成的乙烯釋放劑，被廣泛應(yīng)用于橡膠樹(shù)的刺激采膠，大幅度提高了天然橡膠的產(chǎn)量。研究證實(shí)，乙烯利刺激增產(chǎn)主要是通過(guò)延長(zhǎng)乳管的排膠時(shí)間和提高乳管細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)的［28－29］。因 此，HbMKK4 基因可能通過(guò)茉莉酸信號(hào)途徑在橡膠樹(shù)乳管防衛(wèi)及橡膠的生物合成中起著重要的作用，但是具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的鑒定。

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