香蕉MaPIP2－6基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

侯曉婉，胡 偉，顏 彥，徐碧玉，金志強(qiáng)＊

（1 海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海口570228；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實驗室，?？?71101）

香蕉是熱帶和亞熱帶發(fā)展中國家最重要的作物之一，具有很高的營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)和藥用價值，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為世界第四大糧食作物。因其特有的淺根和需要大量水份維持的永久性綠色樹冠，香蕉對任何條件引起的水份缺失異常敏感［1］。很多非生物脅迫，如低溫、干旱、鹽害均可能導(dǎo)致細(xì)胞脫水，因此研究香蕉如何響應(yīng)非生物脅迫的危害顯得尤為重要。

水是任何生命細(xì)胞最重要的組成成分，是所有有機(jī)體中的主要溶劑。水在植物體不同組織之間通過質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑完成運(yùn)輸［2］。質(zhì)外體途徑運(yùn)輸主要是通過環(huán)境因素，如土壤、植物、大氣之間水電位的變化實現(xiàn)的［3］；而共質(zhì)體途徑運(yùn)輸則主要是通過水通道蛋白（aquaporin，AQP）亞家族實現(xiàn)的［4］。AQP通過增加膜的滲透性有效地促進(jìn)了高等植物體內(nèi)水分子在膜之間的運(yùn)輸，調(diào)節(jié)著種子的萌發(fā)、細(xì)胞伸長、氣孔的開閉和韌皮部的裝載和卸載、生殖生長和植物的脅迫響應(yīng)［5－6］。

在植物中，AQP 屬于膜內(nèi)嵌蛋白（a class of major intrinsic proteins，MIP）的一個大的亞家族，被劃分為4個分支，分別為質(zhì)膜內(nèi)嵌蛋白（the plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）、液泡膜內(nèi)嵌蛋白（the tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、小堿性膜內(nèi)嵌蛋白（the recently characterized small basic intrinsic proteins，SIPs）和 類nodulin 26膜內(nèi)嵌蛋白（the NOD－26－like intrinsic proteins，NIPs）［7－9］。所 有4 個分支均有高度保守的結(jié)構(gòu)域——6個跨膜α螺旋被連接在N 端和C 端總是朝向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的5個短環(huán)上［2］。在水份選擇通道形成中起重要作用的保守天冬酰胺－脯氨酸－丙氨酸元件存在于其中兩個短環(huán)上［10］。在水稻、擬南芥等物種中已證明AQP 家族基因能在轉(zhuǎn)錄水平受逆境脅迫誘導(dǎo)，在植物對逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［11－12］，但在香蕉中AQP家族基因的研究還非常有限。

本研究從香蕉中克隆出一個MaPIP2－6基因，并對其在逆境脅迫及ABA 處理下的表達(dá)模式作研究，為進(jìn)一步研究MaPIP2－6基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材 料

生長正常的巴西蕉（MusaAAA Cavendish cv．Brazilian）和粉蕉（MusaABB Pisang Awak）的五葉一心期幼苗，取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州組培中心。

1．2 目的基因的獲得

從香蕉A 基因組測序數(shù)據(jù)庫中得到一個AQP家族基因（GSMUA＿Achr1T02360），根據(jù)ORF 序列設(shè)計1 對引物MaPIP2－6F1 和MaPIP2－6R1（表1），擴(kuò)增MaPIP2－6cDNA 全長序列。PCR 擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5s；94℃變性40s；55℃退火40 s；72℃延伸1min 30s；共35個循環(huán)。按照分子克隆實驗指南進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化，挑取單克隆在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進(jìn)行PCR 鑒定［13］。對已鑒定的陽性克隆進(jìn)行測序分析。

1．3 生物信息學(xué)分析

在NCBI中利用BLASTX 進(jìn)行序列同源性分析，從中選取相似性較高的同源序列用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對，利用MEGA 5．0軟件對水稻AQP基因家族和克隆出的MaPIP2－6基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．4 MaPIP2－6亞細(xì)胞定位分析

1．4．1 瞬時表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)目的基因MaPIP2－6序列設(shè)計帶有NcolⅠ／SpeⅠ酶切位點(diǎn)且不含終止子的引物MaPIP2－6F2和MaPIP2－6R2（表1）。以正常生長的巴西蕉幼苗葉片cDNA 為模版進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到克隆載體pMD18－T（Takara公司）上，獲得重組質(zhì)粒，陽性克隆測序正確后，用NcolⅠ／SpeⅠ進(jìn)行雙酶切并回收目的片段。同時，利用NcolⅠ／SpeⅠ雙酶切并回收的pCAMBIA1302 載體大片段。利用購自BioLab試劑公司的T4連接酶將目的片段和載體片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（天根生化科技有限公司）感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR 和質(zhì)粒雙酶切驗證后，進(jìn)行測序分析，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP。將測序正確的陽性克隆的質(zhì)粒以及pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。

1．4．2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP和空載體（pCAMBIA1302－GFP）導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中［14］。隨后將洋蔥表皮放在鋪有濾紙的MS培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)16～24h，然后制作裝片，通過FluoViewTMFV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物及其序列Table 1 Primers and sequences required in PCR amplification

1．5 基因的表達(dá)分析

將生長一致的五葉一心期的巴西蕉和粉蕉幼苗分別分成4組。第1組將300 mmol／L 甘露醇（上海生工生物工程有限公司）持續(xù)澆在放置香蕉幼苗的托盤中，處理7、10、15、17d；第2組將300mmol／L NaCl持續(xù)澆在放置香蕉幼苗的托盤中，處理8、12、24、32d；第3組將香蕉幼苗放置在8℃的低溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)往托盤中澆清水，冷害下處理10、22、47h，之后將處理47h的幼苗置于人工氣候培養(yǎng)箱中恢復(fù)1周；第4組用100μmol／L ABA 噴灑香蕉幼苗，處理2、6、12、24h。參照淦國英改良的CTAB 法［15］提取每個處理時間點(diǎn)的香蕉葉片RNA，用自帶DNA 消化酶的cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）反轉(zhuǎn)成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，用TaKaRa 公司的實時熒光定量PCR 試劑盒中的SYBR Green、ROX 染料進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)在吉泰生物科技有限公司Mx3005P熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。以香蕉RPS2基因為內(nèi)參，定量方法為2－ΔΔCt法［16］。設(shè)計引物參考TaKaRa實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)說明書。為了保證引物的特異性，在非翻譯區(qū)設(shè)計引物MaPIP2－6F3／MaPIP2－6R3及MuRPS2F／MuRPS2R（表1），PCR產(chǎn)物的長度維持在300bp 以內(nèi)，并進(jìn)行了測序分析。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR 的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，50℃退火15s，72℃延伸30s，循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2．1 MaPIP 2－6的克隆及序列分析

圖1 MaPIP2－6與水稻AQP家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig．1 Phylogenetic tree of MaPIP2－6 and AQP proteins from rice

以正常生長的巴西蕉幼苗葉片cDNA 為模版、MaPIP2－6F1和MaPIP2－6R1為引物，從香蕉栽培品種巴西蕉中克隆到一個AQP 家族基因，其ORF為849bp，編碼282個氨基酸。從GENBANK 中選擇水稻的全部33 個AQP 家族成員及獲得的香蕉AQP基因推測的氨基酸序列，利用MEGA 5．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明本研究得到的香蕉AQP基因所編碼的氨基酸序列與OsPIP2－6具有較近的親緣關(guān)系，故將該基因命名為MaPIP2－6。BLASTX 分析表明，MaPIP2－6 編碼的氨基酸序列與姜花HcPIP2（AEF32110．1）、野生稻Ob－PIP2－6（XP＿006664814．1）、海棗PdPIP2－6（XP＿008809438．1）編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為93%、89%和87%（圖2）。多序列比對分析表明，MaPIP2－6編碼的蛋白具有PIP 亞家族蛋白的基本特征，其氨基酸序列同樣有6個保守的跨膜螺旋，5 個短環(huán)，一個高度保守的氨基酸序列‘HINPAVTFG’和2 個‘NPA’元件。另外，在MaPIP2－6中也觀察到了所有PIP 成員中共有的保守序列（R／K）DYX（E／D）PP（P／R）X3－4（E／D）XXELXXWSF（Y／W）R。這些結(jié)果表明獲得的MaPIP2－6為香蕉PIP亞家族的成員（圖2）。

2．2 MaPIP2－6蛋白的亞細(xì)胞定位分析

以構(gòu)建的MaPIP2－6 基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP，利用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將其和空載體（pCAMBIA1302－GFP）導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，對MaPIP2－6蛋白在植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布進(jìn)行研究，25℃暗培養(yǎng)16～24h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號在細(xì)胞內(nèi)的分布，結(jié)果顯示35S：GFP綠色熒光蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有表達(dá)（圖3，A），而35S：MaPIP2－6－GFP僅在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)（圖3，B），表明MaPIP2－6蛋白定位在細(xì)胞膜上。

2．3 MaPIP 2－6基因在非生物逆境脅迫及ABA 處理下的表達(dá)分析

利用實時定量PCR 的方法對MaPIP2－6基因在甘露醇、低溫、NaCl、ABA 處理下表達(dá)模式的分析結(jié)果表明，在甘露醇處理下，與對照相比，巴西蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)在處理7d被抑制，處理7～15d呈逐漸上升趨勢，隨后在處理17d后下降；粉蕉中MaPIP2－6 基因的表達(dá)趨勢與在巴西蕉中相似，但是在0、10、15、17d處理時間點(diǎn)的表達(dá)量都高于巴西蕉（圖4，A）。在低溫處理下，巴西蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)與對照相比在處理10h、22 h和恢復(fù)5d沒有明顯變化，處理47h顯著降低；粉蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)與對照相比在處理10 h、22h和恢復(fù)5d明顯降低，但在處理47h沒有明顯變化（圖4，B）。在NaCl 處理下，巴西蕉中，MaPIP2－6基因的表達(dá)在處理8d顯著降低，處理12d升高，隨后在處理24d下降；粉蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)趨勢與在巴西蕉中相似，但是在每個處理時間點(diǎn)的表達(dá)量都低于巴西蕉（圖4，C）。在ABA處理下，與對照相比，巴西蕉中，MaPIP2－6基；因的表達(dá)在處理2～12h 顯著被誘導(dǎo)；粉蕉中，MaPIP2－6基因的表達(dá)在處理2～24h顯著被抑制（圖4，D）。

圖3 MaPIP2－6亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig．3 Subcellular localization of MaPIP2－6fused with GFP

圖4 不同處理下MaPIP2－6基因的相對表達(dá)量Fig．4 Relative expression of MaPIP2－6after different treatments

3 討 論

近年來AQP 家族基因的功能已經(jīng)廣泛被報道，但是關(guān)于香蕉中AQP 家族基因的研究非常有限。本研究從香蕉中克隆了一個AQP 基因（MaPIP2－6），該基因編碼的氨基酸序列具有AQP家族蛋白的基本特征，與其它物種中AQP 家族成員具有較高的一致性，與水稻OsPIP2－6具有較近的進(jìn)化關(guān)系。亞細(xì)胞定位分析表明，MaPIP2－6編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上，與MaPIP1；1和TaAQP7等AQP基因編碼蛋白的細(xì)胞定位結(jié)果一致［17－18］，進(jìn)一步說明了MaPIP2－6具有PIP蛋白的特征。因此，可以推測本研究所克隆的基因是AQP 家族中PIP2亞類中的一個成員。

大量的研究表明AQP家族基因能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)水分的平衡，在植物對逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。在煙草中過表達(dá)的TaAQP7、Ta－AQP8增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性［18－21］。在擬南芥中過表達(dá)的TaNIP和杜鵑花的AQP增強(qiáng)了植株高鹽和低溫的耐受性［20－22］。而且，這些基因都能在轉(zhuǎn)錄水平受相關(guān)非生物逆境脅迫誘導(dǎo)。因此，本研究運(yùn)用實時熒光定量PCR 的方法研究了香蕉MaPIP2－6基因在轉(zhuǎn)錄水平對甘露醇、低溫、高鹽和ABA 的應(yīng)答。結(jié)果表明，在甘露醇和高鹽脅迫處理下，巴西蕉和粉蕉的表達(dá)趨勢基本一致，在處理早期輕微下降，隨后被誘導(dǎo)并達(dá)到最大值，然后下降。這一結(jié)果表明，該基因在響應(yīng)滲透脅迫的過程中，可能在早期出現(xiàn)了一個‘Shock’，隨后呈現(xiàn)出被誘導(dǎo)的趨勢。這一誘導(dǎo)的趨勢 與Lei等［23］報 道OsPIP1－1 和OsPIP2－5 在PEG－6000脅迫下的表達(dá)趨勢一致，而且OsPIP1－1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過表達(dá)增強(qiáng)了其對鹽和干旱的耐受性。

在低溫處理下，粉蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)量在處理前期下降，但之后又增加，在處理47h增加到接近0h處理的表達(dá)量。這一表達(dá)趨勢與Gao等報道TaNIP在低溫脅迫下的表達(dá)趨勢一致［20］。巴西蕉中MaPIP2－6基因的表達(dá)在處理47h達(dá)到最小值，在處理的其它時間點(diǎn)沒有顯著變化。因此，巴西蕉和粉蕉中MaPIP2－6的表達(dá)趨勢相反，說明該基因在巴西蕉和粉蕉中的作用方式可能不同。在擬南芥中，低溫脅迫能夠誘導(dǎo)AtPIP2；5 和At－PIP2；6 基因表達(dá)，但是卻抑制了AtPIP1；1，At－PIP1；2，AtPIP1；5，AtPIP2；2，AtPIP2；3，At－PIP2；4和AtPIP2；7 基因的表達(dá)［24］。因此，AQP家族成員對低溫脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)出不同的模式。而且，在非生物逆境脅迫下，相同的AQP基因在不同品種中也具有不同的表達(dá)模式和不同的功能。因此，MaPIP2－6在巴西蕉和粉蕉中的抗逆功能仍有待于進(jìn)一步研究。

在ABA 處理下，與處理0h對照相比較，巴西蕉和粉蕉中MaPIP2－6 的表達(dá)趨勢完全相反，MaPIP2－6在巴西蕉中顯著被誘導(dǎo)，在粉蕉中則顯著被抑制。巴西蕉中MaPIP2－6的表達(dá)趨勢與Lei研究的水稻在ABA 處理后葉片中OsPIP1－1、Os－PIP1－2、OsPIP2－1、OsPIP2－3、OsPIP2－4 和Os－PIP2－5的表達(dá)趨勢一致［23］。粉蕉中MaPIP2－6的表達(dá)趨勢與Lei研究的水稻在ABA 處理后根中OsPIP1－1、OsPIP1－3、OsPIP2－2、OsPIP2－3、Os－PIP2－4和OsPIP2－5的表達(dá)趨勢一致［23］。這些結(jié)果表明，MaPIP2－6 在巴西蕉和粉蕉中對ABA 的響應(yīng)方式不同。

綜上所述，本研究克隆到的MaPIP2－6基因是AQP家族PIP2亞類中的一個，具備PIP2亞家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征。實時熒光定量PCR 實驗表明MaPIP2－6在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)了甘露醇、低溫、NaCl和ABA 信號。這些結(jié)果表明MaPIP2－6能夠參與非生物逆境脅迫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究MaPIP2－6基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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