紫花苜蓿葉輸導(dǎo)組織解剖結(jié)構(gòu)和光合特性對外源氮的響應(yīng)

張曉玲，劉曉靜＊，郝 鳳

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，蘭州730070；2 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室／中美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州730070）

植物葉片自建立光合能力起，光合產(chǎn)物的運移就由輸導(dǎo)組織維管束來完成［1］，因此葉片的光合能力及輸導(dǎo)組織對光合產(chǎn)物及營養(yǎng)物質(zhì)的運輸能力是作物高產(chǎn)的重要基礎(chǔ)［2］。植物葉片解剖結(jié)構(gòu)對外源氮素的響應(yīng)已有研究，但多集中于大豆［3］、小麥［4］和玉米［5］等作物，且研究目標(biāo)均為葉柵欄組織和海綿組織對外源氮素的響應(yīng)，而針對氮素對植物葉輸導(dǎo)組織的影響方面的研究極少。植物的光合能力受多種因素的影響，已證實氮素可促進(jìn)植物光合能力，如氮素通過調(diào)節(jié)光合電子傳遞能力和光合羧化酶的活性而影響光合速率的高 低［6］。在水稻［7］、玉米［8］和小麥［9－10］上的研究都表明施氮有利于提高葉片葉綠素含量和凈光合速率。植物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能是統(tǒng)一的，光合作用的差異也必然與葉片光合作用器官的解剖學(xué)特性緊密相關(guān)［11］。因此，關(guān)于植物葉片養(yǎng)分輸導(dǎo)能力和光合性能的研究對作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義。

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是重要的豆科牧草，與其它牧草相比，因其富含植物性蛋白且高產(chǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”［12］。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，蛋白飼料嚴(yán)重不足已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)的瓶頸問題。紫花苜蓿的葉集中體現(xiàn)了其營養(yǎng)價值，是蛋白含量最高、纖維含量最低、適口性最好的部位，并且又是進(jìn)行物質(zhì)合成的場所，葉功能直接決定著其營養(yǎng)品質(zhì)，開展紫花苜蓿葉片輸導(dǎo)組織解剖結(jié)構(gòu)和光合特性的研究極具現(xiàn)實意義。有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)牡乜纱龠M(jìn)紫花苜蓿結(jié)瘤固氮，NH4＋－N 使根系明顯變短、加粗，促進(jìn)側(cè)根的形成，從而增強(qiáng)紫花苜蓿營養(yǎng)吸收，促進(jìn)其生物量的積累［13］，粗蛋白含量也隨之提高［14］；同時，施氮能促進(jìn)紫花苜蓿根瘤形成，增加其固 氮能力［15］，并 能 促 進(jìn) 其 地 上 部 的 光 合 作 用［16－17］。外源氮在提高紫花苜蓿生物量［18］和種子產(chǎn)量［19］，提高干物質(zhì)積累和氮積累［20］，改善紫花苜蓿品質(zhì)等方面的作用卓著［21］，本試驗研究了不同供氮條件下紫花苜蓿葉片輸導(dǎo)組織解剖結(jié)構(gòu)和光合特性，探究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以揭示外源氮促進(jìn)紫花苜蓿高效生產(chǎn)的本質(zhì)，為生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿品種為‘甘農(nóng)3 號’（Medicago sativaL.cv.Gannong No.3）和‘隴東苜?！∕edicagosativaL.cv.Longdong），供試菌株為中華根瘤菌（12531），源自苜蓿根瘤和誘變菌株，來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院?！兽r(nóng)3號’由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院育成，抗旱、耐寒，再生能力強(qiáng)，肥料報酬率高，是灌區(qū)的豐產(chǎn)品種，適合于西北內(nèi)陸灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)［22－23］?！]東苜?！堑胤狡贩N，栽培歷史悠久，抗旱性較強(qiáng)，耐寒，長壽，適應(yīng)性強(qiáng)，在旱作條件下高產(chǎn)，主要分布于甘肅隴東地區(qū)，宜在旱作地區(qū)種植［24］。

1.2 材料準(zhǔn)備

1.2.1 根瘤菌培養(yǎng) 將中華根瘤菌（12531）采用平板劃線培養(yǎng)，挑起單個菌落，將其接入YMA 液體培養(yǎng)基［25］。在28 ℃下120r·min－1的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至菌液的光密度值（OD600nm）≥1.0，再在10 000r·min－1下離心10 min，除去上清液用無菌水洗下根瘤菌體并配制成吸光值為0.6的菌懸液，備用。

1.2.2 種子處理 選取大小均勻、顆粒飽滿的紫花苜蓿種子放入滅菌小三角瓶中，先用95%乙醇浸泡5min，再用0.1% HgCl2溶液滅菌6～10min，然后無菌水沖洗5～6 次后用無菌濾紙吸干，備用［26］。

1.2.3 粗砂處理 將粗砂經(jīng)自來水沖洗若干次，直到?jīng)_洗至水不再渾濁，然后用蒸餾水沖2～3次。先經(jīng)121 ℃滅菌，再經(jīng)高溫（150 ℃）烘干后，備用。

1.2.4 營養(yǎng)液配置 以Fahraeus無氮營養(yǎng)液［27］為基本營養(yǎng)液，加入Ca（NO3）2、（NH4）2SO4分別作為來源，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH 為7，結(jié)合無氮營養(yǎng)液一同施入。

1.3 材料培養(yǎng)與處理

根據(jù)前期試驗結(jié)果［28］，兩個紫花苜蓿品種各設(shè)2種氮素形態(tài)、5 個濃度水平（0、105、210、315、420mg·L－1），共9個處理，分別以CK（氮 素 水 平 為0）、表示，每處理重復(fù)15 次，完全隨機(jī)排列。

試驗在室外防雨網(wǎng)室內(nèi)采用盆栽營養(yǎng)液砂培法進(jìn)行。選用高15cm、長20cm、寬12cm 的花盆，裝入經(jīng)自來水沖洗，再用蒸餾水清洗并滅菌的粗砂3 kg。2014年4月11日播種，每盆播種50粒滅菌種子，播種7d后間苗，每盆留苗30株，然后開始澆入營養(yǎng)液，每周澆250mL，每7d用蒸餾水淋洗盆栽1次以防止砂培中鹽分積累，而后澆入新配置營養(yǎng)液。紫花苜蓿生長至三片復(fù)葉時，每盆接種新培養(yǎng)的苜蓿根瘤菌液25 mL。培養(yǎng)60d時紫花苜蓿已到初花期，大部分已經(jīng)現(xiàn)蕾，此時取樣測定各指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 葉片解剖結(jié)構(gòu) 取第3葉位之三出復(fù)葉中間小葉，將新鮮的葉片立即在FAA 固定液中固定并保存，采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，先經(jīng)酒精系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，LEICA 全自動切片機(jī)切片，厚度10μm，充分烤片后，進(jìn)行番紅－固綠雙重對染，中性樹膠封片。切片制作完畢，置于Carl Zeiss光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照（圖1），并利用Axio－Vision軟件測微尺測量維管束、木質(zhì)部、韌皮部面積［29］及導(dǎo)管數(shù)量，每個處理選取3 個樣本，每個樣本隨機(jī)取10個視野求平均值。

1.4.2 葉片光合生理特性 葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度采用GFS－3000 光合儀（Walz，Germany）測定，測定時間為上午9：00～11：00；葉面積采用描形稱重法測定［30］；葉綠素含量采用丙酮浸提法測定［31］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，應(yīng)用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮素處理對紫花苜蓿葉片輸導(dǎo)組織解剖結(jié)構(gòu)的影響

圖1 不同氮素處理下紫花苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)（×200；標(biāo)尺＝50μm）Fig.1 Different nitrogen treatments on anatomical structure of alfalfa leaf（×200；Scale bars＝50μm）

相比于CK（圖1，A、B），供氮條件下‘甘農(nóng)3號’和‘隴東苜?！▓D1，C－R）的葉表皮由長圓形排列更為緊密的單層細(xì)胞組成，葉脈凸起明顯，橫截面積較大，維管束在橫截面中所占比例增大，木質(zhì)部和韌皮部發(fā)達(dá)。木質(zhì)部有孔徑較大細(xì)胞壁加厚的木質(zhì)導(dǎo)管，且數(shù)量多并呈放射狀排列。厚角組織細(xì)胞大且數(shù)量多。隨著供氮水平的增高，2品種、2氮素形態(tài)下紫花苜蓿維管束面積、木質(zhì)部面積、韌皮部面積和導(dǎo)管數(shù)均呈先增加后降低的趨勢，并均在210 mg·L－1供氮水平下表現(xiàn)最大（圖1，G－J，表1）。

2.2 不同氮素處理對紫花苜蓿光合特性的影響

圖2 不同氮素處理對紫花苜蓿光合特性的影響Fig.2 Effects of different nitrogen treatments on photosynthetic characteristics of alfalfa

表1 不同氮素處理對紫花苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table1 Effects of different nitrogen treatments on anatomical structure of alfalfa leaf

表2 不同氮素處理對紫花苜蓿葉面積和葉綠素含量的影響Table2 Effects of different nitrogen treatments on leaf area and chlorophyll content of alfalfa

2.2.1 凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度 從圖2可看出，氮素對紫花苜蓿葉片光合性能有明顯的調(diào)節(jié)作用。其凈光合速率（Pn）和氣孔導(dǎo)度（Gs）變化規(guī)律一致，供氮處理均顯著高于CK（P＜0.05），并隨供氮水平的增加呈先增后減趨勢，在210mg·L－1供氮水平下達(dá)到峰值。同一氮素水平下，除‘隴東苜?！?15mg·L－1和420mg·L－1水平 下 的 凈 光 合 速 率 表 現(xiàn) 為培 養(yǎng) 高 于培養(yǎng)，其余各處理均為培養(yǎng)高于培養(yǎng)。因此，在處理下，葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度對氮素反應(yīng)最為敏感。對于2品種來說，除培養(yǎng)下315mg·L－1和420 mg·L－1水平的光合速率表現(xiàn)為‘隴東苜?！哂凇兽r(nóng)3號’外，其他各處理光合速率、氣孔導(dǎo)度則均表現(xiàn)為‘甘農(nóng)3號’高于‘隴東苜?！Ａ硗?，紫花苜蓿胞間二氧化碳濃度（Ci）則與凈光合速率表現(xiàn)大體呈相反趨勢，隨氮素水平的提高而降低。

2.2.2 葉面積和葉綠素含量 由表2可見，不同供氮處理下‘甘農(nóng)3號’和‘隴東苜?！~面積、葉綠素含量變化趨勢一致，供氮處理均顯著高于CK（P＜0.05）。2種氮素形態(tài)下，均隨供氮水平的增高呈先增加后降低的趨勢，并在210mg·L－1供氮水平下達(dá)到峰值。同一氮素水平下，整體上表現(xiàn)為N 培養(yǎng)高于培養(yǎng)。因此，2品種紫花苜蓿的葉面積、葉綠素含量均在N、210mg·L－1達(dá)最大值。對于2品種來說，各處理的葉面積、葉綠素含量表現(xiàn)為‘甘農(nóng)3 號’高于‘隴東苜?！?；在N、210mg·L－1濃度時，‘甘農(nóng)3號’的葉面積、葉綠素含量分別為1.56cm2、2.18mg·g－1，與‘隴東苜蓿’相比分別增加了6.1%、14.1%。

3 討 論

3.1 紫花苜蓿葉片輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)對氮素的響應(yīng)

葉片組織結(jié)構(gòu)決定組織功能［32］，維管束的大小決定紫花苜蓿運輸養(yǎng)分的能力。本研究中，供氮處理的紫花苜蓿葉片木質(zhì)部面積、韌皮部面積及導(dǎo)管數(shù)量均顯著高于無氮處理，可見紫花苜蓿輸導(dǎo)組織對養(yǎng)分的豐缺有適應(yīng)性的響應(yīng)。宋朝玉等［33］在玉米上的研究也發(fā)現(xiàn)葉片向果穗輸送光合產(chǎn)物也受到氮素的調(diào)控，從而影響產(chǎn)量。本試驗中，在供氮水平≤210mg·L－1時，紫花苜蓿木質(zhì)部面積、韌皮部面積及導(dǎo)管數(shù)量與供氮水平呈正相關(guān)，但供氮水平＞210mg·L－1時各指標(biāo)有所下降，說明適宜的氮素水平可促進(jìn)紫花苜蓿維管束細(xì)胞的增大，從而增強(qiáng)輸導(dǎo)組織對養(yǎng)分的運輸能力，進(jìn)而影響葉片光合速率和光合產(chǎn)物運輸效率，表現(xiàn)在植株葉面積的增大。這與陳火英等［5］對爆裂型玉米的研究結(jié)果相似。此外，紫花苜蓿在培養(yǎng)下的木質(zhì)部面積、韌皮部 面積及導(dǎo) 管 數(shù) 量 大 于培 養(yǎng)，說 明更有利于促進(jìn)細(xì)胞體積的增大、維管束的發(fā)育。陳冬梅［34］在不同氮源對白羽扇豆根系解剖結(jié)構(gòu)上的研究上也得出了相同的結(jié)論。因此，、210 mg·L－1處理最有利于提高紫花苜蓿養(yǎng)分運輸?shù)哪芰Α?/p>

3.2 紫花苜蓿光合特性對氮素的響應(yīng)

有研究證實影響光合速率的因素有2個［35］，一是氣孔因素，二是葉肉細(xì)胞羧化能力，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶（RuBPCase）是碳同化途徑關(guān)鍵酶，氮素通過影響RuBPCase的活性，進(jìn)而影響電子傳遞的速率。當(dāng)光合速率和胞間CO2濃度變化相同時，光合速率的影響原因是氣孔的限制；當(dāng)光合速率和胞間CO2濃度變化趨勢相反，則歸因于葉肉細(xì)胞的羧化能力。本研究結(jié)果表明，隨著氮素濃度的增加，紫花苜蓿葉片的凈光合速率和胞間CO2濃度變化趨勢相反，表明氮素對紫花苜蓿光合速率的影響是由于葉肉細(xì)胞羧化能力的改變而致。栗娜娜等［36］在對青花菜的研究中發(fā)現(xiàn)氮素是通過影響光合機(jī)構(gòu)或暗反應(yīng)酶活性來影響其光合作用，施氮會使光合作用中重要的RuBP 羧化酶數(shù)量上升，從而提高光合作用。本研究中，供氮水平在210mg·L－1時，葉片凈光合速率最大，表明適宜的氮素水平可促進(jìn)紫花苜蓿的光合作用效率。吳家勝等［37］對銀杏葉片光合速率的研究結(jié)論與此一致。與此同時，紫花苜蓿在培養(yǎng)下的光合速率高于培養(yǎng)，郭培國等［38］等對烤煙研究發(fā)現(xiàn)隨比例增加，葉片中的希爾反應(yīng)活力逐漸上升，光合磷酸化活力也有所升高，從而提高了水的光解和電子傳遞的速率，因此增加比例有利于光合能力的提高。Raab等［39］也發(fā)現(xiàn)甜菜葉片的光合速率在營養(yǎng)下比在營養(yǎng)下高。可見不同的氮素形態(tài)對紫花苜蓿的光合特性的影響不同，且作用更佳。因此，、210 mg·L－1處理更大程度提高紫花苜蓿光合特性。

3.3 不同紫花苜蓿品種解剖結(jié)構(gòu)和光合特性對氮素的響應(yīng)

植物葉片形成的光合同化物在韌皮部中運輸時，韌皮部橫截面積和源庫路徑長度是運輸能力的主要決定因子［40］，因而維管束的發(fā)育程度會限制光合同化物的運輸能力，古世祿等［41］對谷子的研究中也證實了該結(jié)論。植物輸導(dǎo)組織的發(fā)達(dá)程度可以衡量營養(yǎng)物質(zhì)的運轉(zhuǎn)效率，當(dāng)其通道能力達(dá)到飽和時，便會限制其生長速度，即所謂的“輸導(dǎo)限制”［42］。因此，在本研究中2品種紫花苜蓿輸導(dǎo)組織維管束面積和凈光合速率均在處理最大，說明紫花苜蓿維管束的通道能力在處理下達(dá)到飽和，輸導(dǎo)組織運送養(yǎng)分的能力最強(qiáng)，光合產(chǎn)物的運輸效率最高，從而優(yōu)化了其光合特性，促進(jìn)了其光合效率。2品種相比，氮素對‘甘農(nóng)3號’葉片輸導(dǎo)組織的改善作用和光合作用均大于‘隴東苜?！?，說明‘甘農(nóng)3號’較‘隴東苜蓿’對氮肥更敏感，肥料報酬率高。曹致中［22］認(rèn)為‘甘農(nóng)3號’紫花苜蓿生產(chǎn)性能優(yōu)良，高產(chǎn)，對肥料利用效率也較突出，適應(yīng)于西北內(nèi)陸灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)和黃土高原地區(qū)栽培。劉艷楠等［43］在施肥與刈割對不同紫花苜蓿品種生產(chǎn)性能的影響中也得出相同的結(jié)論。Carlson等［44］、Sheridan［45］也報道了不同苜蓿品種光合速率明顯不同，高產(chǎn)苜蓿具有較高比葉重和凈光合速率。因此，氮素對紫花苜蓿養(yǎng)分運輸能力和光合作用的改變上也存在品種差異。

綜上所述，氮素能通過改善紫花苜蓿葉片輸導(dǎo)組織的解剖結(jié)構(gòu)和光合特性，促進(jìn)紫花苜蓿光合作用效率，提高紫花苜蓿運輸營養(yǎng)物質(zhì)和合成有機(jī)物的能力、改善其生產(chǎn)性能和營養(yǎng)品質(zhì)；相同氮素水平，比的改善效果更佳，并以、210 mg·L－1處理表現(xiàn)最優(yōu)；品種間相比，‘甘農(nóng)3號’較‘隴東苜?！瘜Φ史磻?yīng)更敏感，受到調(diào)控的效果更好。

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