Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經(jīng)元中的表達(dá)及意義①

黃昕艷，尉榮翠，楊 智，李 壯，劉 爽

(1．佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002；2．佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003；3．佳木斯大學(xué)遺傳教研室，黑龍江 佳木斯 154002)

Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經(jīng)元中的表達(dá)及意義①

黃昕艷1，尉榮翠1，楊 智1，李 壯2，劉 爽3

(1．佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002；2．佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003；3．佳木斯大學(xué)遺傳教研室，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經(jīng)元中的表達(dá)及意義。方法：應(yīng)用新生(3d以內(nèi))SD大鼠采用急性分離、胰酶消化的方法培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，分別于Aβ25-35致傷0h、8h、16h、24h，并采用免疫細(xì)胞染色觀察各時(shí)間點(diǎn)Chk1/chk2表達(dá)情況。結(jié)果：體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，免疫細(xì)胞染色鑒定結(jié)果表明Chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經(jīng)元后，隨致傷時(shí)間延長均有表達(dá)，且以chk1表達(dá)顯著，在致傷16h有差異明顯(P<0.05)。結(jié)論：Chk1/chk2共同參與了在Aβ致傷海馬神經(jīng)元中的DNA損傷修復(fù)，以chk1表達(dá)更顯著，提示可望為AD中神經(jīng)元的DNA損傷修復(fù)提供新的干預(yù)點(diǎn)。

海馬神經(jīng)元；Chk1/chk2；Aβ

近年來的研究指出，細(xì)胞周期的異?？赡苁茿D發(fā)生的較早期事件，這種異常的細(xì)胞周期可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，最終引發(fā)AD。成熟神經(jīng)元再進(jìn)入細(xì)胞周期與DNA損傷有關(guān)，在DNA損傷修復(fù)過程中不可回避的涉及到細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶Chk1和(或)Chk2的活化[1]，而Chk1和(或)Chk2在Aβ致傷神經(jīng)元中的激活情況尚未見報(bào)道，故本研究以Aβ致傷神經(jīng)元為AD的細(xì)胞模型，探討Chk1和Chk2在Aβ致傷神經(jīng)元的表達(dá)差異，為AD中神經(jīng)元的DNA損傷修復(fù)提供全新的干預(yù)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

新生SD大鼠(1～3d)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：黑動(dòng)字第99102001)。藥物及試劑 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27、胎牛血清均購自美國Sigma公司，Aβ25-35購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠單克隆神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)單克隆抗體、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒購于Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)[2]

選用出生3d內(nèi)的SD大鼠，解剖分離出海馬，經(jīng)0.125%胰酶消化8～12min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12種植液終止消化。經(jīng)懸浮、離心、過濾等步驟收集細(xì)胞，用種植液制成密度為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換含2%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3d半量換液1次。

1.2.2 原代神經(jīng)元鑒定[3，4]

NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：培養(yǎng)至第7d的神經(jīng)細(xì)胞，以PBS輕洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4% TritonX-100破膜20min，PBS洗3遍，山羊封閉血清封閉30min，滴加NSE(1：200稀釋) 一抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。次日加二抗室溫避光孵育50min，加新鮮配制的DAB溶液顯色，光鏡觀察。

1.2.3 Aβ25-35致傷及實(shí)驗(yàn)分組

海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7d后，棄原培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液及終濃度為10μmol/L的Aβ25-35(前期實(shí)驗(yàn)篩選的最佳致傷濃度)孵育，Aβ25-35肽分別孵育0h、8h、16h、24h終止培養(yǎng)，分別以chk1、chk2為一抗，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。每組6孔，每張蓋玻片上隨機(jī)選取6個(gè)視野，高倍鏡下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測(cè)定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)<10%者0分；10%～40%者1分；40%～70%者2分；>70%者3分。兩種評(píng)分相乘，結(jié)果記為免疫化學(xué)評(píng)分值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

接種后的海馬神經(jīng)細(xì)胞呈圓形，單個(gè)均勻分布，2h后開始貼壁，培養(yǎng)24h后細(xì)胞大部貼壁且部分已長出突起，隨養(yǎng)時(shí)間延長，突起逐漸增多、延長并交織成網(wǎng)。培養(yǎng)至7d細(xì)胞生長成熟，見圖1。NSE免疫染色顯示90%以上的培養(yǎng)細(xì)胞為陽性染色，符合細(xì)胞原代培養(yǎng)純度要求，見圖2。

圖1 7d，神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)7d(×200)

圖2 7d，NSE免疫細(xì)胞染色(DAB顯色)

2.2 Chk1、Chk2蛋白在Aβ致傷神經(jīng)元中的表達(dá)

Chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經(jīng)元后，隨致傷時(shí)間延長均有表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)定位在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，并以細(xì)胞核為主。 Chk1與chk2蛋白表達(dá)在0h、8h無顯著差異，在致傷16h及24h， Chk1與chk2蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，且chk1與chk2表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1 chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經(jīng)元中的表達(dá)(免疫化學(xué)積分)

注：*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；△與chk2蛋白表達(dá)比較P<0.05。

3 討論

Aβ可通過多種途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，近年來提出了AD發(fā)病過程中大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的假說-細(xì)胞周期假說。CHK1、CHK2是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白，在DNA損傷所致的周期阻滯中起到重要作用，其不僅能夠引起細(xì)胞周期阻滯，而且還直接或間接參與了DNA損傷的修復(fù)過程[5]。

在本研究中，通過免疫細(xì)胞化學(xué)觀察，Aβ肽致傷神經(jīng)細(xì)胞的8h、16h、24h均可看到CHK1、CHK2的蛋白表達(dá)，在Aβ肽致傷16h時(shí)CHK1、CHK2表達(dá)顯著，同時(shí)可以看到CHK1、CHK2相比較，CHK1的表達(dá)更明顯，CHK1和CHK2功能上的相互重疊增強(qiáng)了損傷細(xì)胞的自我保護(hù)能力。

DNA受損后，可觸發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，DNA修復(fù)蛋白復(fù)雜多樣，作為DNA損傷修復(fù)的關(guān)卡反應(yīng)蛋白，有研究報(bào)道CHK1或CHK2的高表達(dá)可以提高DNA修復(fù)效率，改變細(xì)胞凋亡的命運(yùn)[6]。

目前，CHK抑制劑在阻止細(xì)胞周期停滯、抑制DNA修復(fù)，誘導(dǎo)DNA損傷細(xì)胞凋亡方面的研究受到廣泛關(guān)注[7，8]，大量結(jié)果表明CHK抑制劑在抑制DNA修復(fù)的治療中越來越顯現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)[9]，這些問題的解決對(duì)于挽救AD中大批損傷神經(jīng)元的命運(yùn)至關(guān)重要。而隨著細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)和DNA修復(fù)機(jī)制研究的深入，針對(duì)性的選擇周期檢驗(yàn)點(diǎn)或DNA修復(fù)通路中的關(guān)鍵蛋白，已成為近年來干預(yù)細(xì)胞周期治療的新靶點(diǎn)。

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[2]王廷華，馮忠堂.神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)理論與技術(shù)[M]．北京：科學(xué)出版社，2005，83-84

[3]黃昕艷,趙錦程,尉榮翠,等. Aβ_(25-35)寡聚體對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的活性影響及形態(tài)學(xué)觀察[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(3)：218-221

[4]胡旭慧，黃昕艷，朱曉峰. Aβ_(25～35)寡聚體對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸的損傷作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33(3)：113

[5]馮旭，黃昕艷，江清林，等. BDNF對(duì)Aβ致傷大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能修復(fù)的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(6)：7-10

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黑龍江省教育廳課題，編號(hào)：12521570和12521543。

黃昕艷(1969～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師。

劉爽(1975～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授。E-mail:lockandkey@sina.com。

R741.02

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1008-0104(2015)01-0072-02

2014-08-12)