草菇菌種退化相關(guān)分子標(biāo)記的篩選

李丹青，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

草菇菌種退化相關(guān)分子標(biāo)記的篩選

李丹青，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

【目的】 基于SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出與草菇(Volvariellavolvacea)菌絲退化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記,為進(jìn)一步研究目標(biāo)性狀基因的克隆與功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以草菇正常生長(zhǎng)菌株V51(對(duì)照)與其菌絲退化菌株(VNM1～10)為材料，采用群體分離分析法分別構(gòu)建2種草菇的近等基因池。利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，尋找兩類(lèi)菌株的差異片段，回收差異片段后與pMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-VNMDF并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，將篩選的陽(yáng)性克隆測(cè)序。根據(jù)差異片段序列設(shè)計(jì)引物，將其轉(zhuǎn)化成SCAR分子標(biāo)記，并對(duì)草菇正常菌株V51及其菌絲退化菌株VNM進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，驗(yàn)證該標(biāo)記的真實(shí)性和可靠性?！窘Y(jié)果】 81對(duì)SRAP引物組合中有2對(duì)引物可擴(kuò)增出穩(wěn)定差異條帶，其中引物對(duì)Me8-Em4 PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約300 bp的差異條帶(命名為VNMDF)存在于退化菌株中。對(duì)SRAP分子標(biāo)記片段VNMDF回收、測(cè)序并進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段長(zhǎng)度為279 bp，其核酸、氨基酸序列與編碼26S蛋白酶體亞基的相似性分別達(dá)到81%和93%。利用SCAR特異引物對(duì)SCAR250可在菌絲退化菌株中穩(wěn)定擴(kuò)增出長(zhǎng)度約250 bp片段，與預(yù)期大小(279 bp)一致，而在正常菌株中未擴(kuò)增出此片段?！窘Y(jié)論】 獲得了1條可能與草菇菌絲退化性狀基因緊密連鎖的SRAP分子標(biāo)記，并將其成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記(SCAR250)。

草菇；菌種退化；SRAP；SCAR

草菇(Volvariellavolvacea)是世界產(chǎn)量第五的重要食用菌，也是我國(guó)主要出口菇類(lèi)之一。草菇品質(zhì)鮮嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，食藥兼用，在國(guó)內(nèi)外素享盛名，素有“中國(guó)蘑菇”之稱(chēng)[1]。同其他食用菌相比，草菇具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)周期短，從播種到收獲只要10 d左右[2]。而且，發(fā)展草菇產(chǎn)業(yè)有利于農(nóng)業(yè)生態(tài)的良性循環(huán)。因此，草菇是極具發(fā)展?jié)摿Φ氖秤镁N類(lèi)。

然而在草菇的生產(chǎn)實(shí)踐中，一個(gè)優(yōu)良的菌種使用一段時(shí)間或繼代培養(yǎng)幾代后就會(huì)發(fā)生退化，嚴(yán)重的菌種退化現(xiàn)象制約了草菇產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。菌種退化是菌類(lèi)栽培過(guò)程中普遍存在的現(xiàn)象，也是生產(chǎn)當(dāng)中迫切希望得到解決的問(wèn)題。退化菌種在外部形態(tài)上表現(xiàn)為菌絲細(xì)弱，氣生菌絲稀疏，菌絲生長(zhǎng)緩慢，容易被雜菌污染；生產(chǎn)上表現(xiàn)為出菇期推遲，成菇數(shù)目減少，出菇不整齊，產(chǎn)量下降等[3]。病毒、細(xì)菌通過(guò)潛伏感染或與菌絲體共生干擾細(xì)胞內(nèi)正常的代謝活動(dòng)可引起菌種退化[4]。此外，不良環(huán)境條件，如紫外線(xiàn)引起DNA中堿基錯(cuò)配等，也可造成菌種退化[5]。

到目前為止，盡管關(guān)于食用菌菌種退化的研究取得了一定的進(jìn)展，但主要集中于導(dǎo)致退化的環(huán)境因素分析及利用有性循環(huán)、原生質(zhì)體融合和遺傳工程等途徑進(jìn)行菌株改良等方面，且這些研究主要是通過(guò)菌種的提純復(fù)壯以及組織或單孢分離選育新菌種[6-8]。對(duì)菌種退化機(jī)制的研究?jī)H有關(guān)于雙孢蘑菇染色體非正常性突變[9]以及退化蛹蟲(chóng)草株DNA水平上發(fā)生突變[10]的報(bào)道。目前尚未見(jiàn)到對(duì)退化草菇菌種遺傳分析或草菇菌種退化機(jī)制的研究報(bào)道。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記分析生物的系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳變異、基因定位、分離與克隆等已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。自從1992年Khush等[11]首次報(bào)道用PCR技術(shù)構(gòu)建雙孢蘑菇的分子標(biāo)記以來(lái)，RAPD、AFLP、ISSR、SCAR等分子標(biāo)記技術(shù)被相繼應(yīng)用于雙孢蘑菇[12-14]、香菇[15-17]、草菇[18-19]、金針菇[20]、銀耳[21]、黑木耳[22-23]等領(lǐng)域的研究中，在食用菌的遺傳育種、菌種和菌株鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆等方面發(fā)揮了巨大作用，極大地提升了食用菌的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究水平，為這一領(lǐng)域研究的深入和拓展展現(xiàn)了光明的前景。

SRAP(Sequence related amplified polymorphism)技術(shù)是通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，具有較高的多態(tài)性水平，能夠比較容易地分離目的標(biāo)記并測(cè)序，并且無(wú)需事先了解基因組序列信息，具有操作簡(jiǎn)便、快速、僅需微量DNA等特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究[24-25]和種質(zhì)資源的鑒定[26]。Paran等[27]發(fā)明了序列特征性擴(kuò)增區(qū)域(Sequence-characterized amplification region，SCAR)分子標(biāo)記技術(shù)，它最初是從RAPD分子標(biāo)記技術(shù)衍生而來(lái)，對(duì)于依靠AFLP以及SRAP等技術(shù)獲得的多態(tài)性片段也可應(yīng)用。與SRAP相比，SCAR標(biāo)記無(wú)需在樣品鑒定時(shí)篩選大量的引物，特異性更強(qiáng)，一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片段的有無(wú)，適用于大量個(gè)體的快速檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中，具有快速、簡(jiǎn)便和低成本的優(yōu)越性。但至今尚未見(jiàn)到將SRAP和SCAR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于草菇菌種退化研究方面的報(bào)道。本研究擬以現(xiàn)有的菌絲退化草菇菌株與其菌絲正常菌株為試驗(yàn)材料，采用群體分離分析法(Bulked segregation analysis，BAS)[28]開(kāi)展草菇菌種退化的SRAP分子標(biāo)記研究，對(duì)所獲得的基因片段進(jìn)行分析驗(yàn)證，從中篩選出與退化性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為進(jìn)一步研究目標(biāo)性狀基因的克隆與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 草菇V51正常菌株(對(duì)照)及其菌絲退化菌株VNM1～10，為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物煉制實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引 物 SRAP引物設(shè)計(jì)、篩選參考Li等[29]的方法，從其所用引物中隨機(jī)選取9個(gè)上游引物和9個(gè)下游引物組合，共81對(duì)引物(表1)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 本研究中所用的SRAP引物組合Table 1 SRAP primer pairs in this study

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取和DNA池的構(gòu)建 將草菇正常菌株及其菌絲退化菌株母種從試管接種到PDA固體培養(yǎng)基上，于32 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板，保證足夠量的菌絲用于基因組DNA提取。草菇基因組DNA的提取按照王藝紅等[30]的FDEB法。參照Altinkut等[28]的群體分離分析方法，取對(duì)照菌株V51 200 μL基因組DNA，構(gòu)建DNA池1；取VNM1～10基因組DNA各20 μL等量混合，構(gòu)建DNA池2，用于篩選特異性標(biāo)記。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 25 μL SRAP-PCR反應(yīng)體系中，含dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，基因組DNA (50 ng/μL)1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)1.5 μL，下游引物(10 μmol/L)1.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×PCR buffer(含20 mmol/L Mg2+)2.5 μL，其余為雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳分離，電泳后經(jīng)電泳凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)成像檢測(cè)。

1.2.3 差異片段克隆及序列測(cè)定 參照DNA純化回收試劑盒(TIANGEN公司)說(shuō)明書(shū)回收PCR產(chǎn)物差異片段。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pMD-VNMDF，將其轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選的陽(yáng)性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLASTN和BLASTX搜索并進(jìn)行分析。

1.2.4 SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記 SRAP分子標(biāo)記雖具有較高的多態(tài)性水平，但是特異性較差，限制了其實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。而SCAR標(biāo)記特異性更強(qiáng)，更為實(shí)用。因此，本研究根據(jù)獲得的SRAP差異片段序列，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)SCAR特異引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用設(shè)計(jì)的SCAR特異引物對(duì)草菇正常菌株V51及其菌絲退化菌株進(jìn)行擴(kuò)增，確認(rèn)建立的SCAR 標(biāo)記的真實(shí)性和可靠性。PCR反應(yīng)的退火溫度調(diào)整為58 ℃，其他同SRAP-PCR一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇基因組DNA的提取

提取菌絲生長(zhǎng)退化草菇菌株VNM以及對(duì)照草菇菌株V51(圖1)的基因組DNA，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，DNA純度較高，結(jié)構(gòu)完整，帶型整齊一致，無(wú)明顯降解現(xiàn)象(圖2)，因此可以用于進(jìn)一步構(gòu)建DNA池和SRAP分析。

2.2 草菇SRAP標(biāo)記的篩選

用81對(duì)SRAP引物組合對(duì)菌絲退化草菇菌株VNM和菌絲正常對(duì)照菌株V51的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)大部分引物組合都有擴(kuò)增條帶，片段長(zhǎng)度在50～2 000 bp，平均每對(duì)引物組合可擴(kuò)增出約25條清晰的條帶(圖3)。大部分引物組合在2種菌株間擴(kuò)增圖譜相同。經(jīng)3次重復(fù)后，有2對(duì)引物在2種菌株基因組DNA間存在穩(wěn)定的差異，分別是Me8-Em2、Me8-Em4，擴(kuò)增除了明顯的差異條帶，其中僅Me8-Em4在菌絲退化菌株中多出1條特異條帶，大小約為300 bp(圖4)，經(jīng)多次重復(fù)驗(yàn)證，該差異條帶表現(xiàn)穩(wěn)定。

圖2 草菇菌株基因組DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果(部分結(jié)果)M.Marker 3；1.V51；2～9.VNM1～8Fig.2 Agarose gel analysis of genomic DNA (part) of Volvariella volvacea strainsM.Marker 3；1.V51；2-9.VNM1-8

圖3 基于81對(duì) SRAP 引物的草菇基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果(部分結(jié)果)M.Marker 3；1.V51；2～6.VNMFig.3 PCR amplification product of SRAP (part) of Volvariella volvacea strainsM.Marker 3；1.V51；2-6.VNM

2.3 草菇退化相關(guān)差異片段的克隆及測(cè)序

將擴(kuò)增得到的差異片段與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-VNMDF轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選的陽(yáng)性克隆委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(圖5)顯示，所得片段長(zhǎng)度為279 bp，將其命名為VNMDF。在GenBank中進(jìn)行BLASTN搜索，結(jié)果顯示，所得序列與MoniliophthoraroreriMCA 2997 26S蛋白酶體亞基ATPase 3部分mRNA序列(GenBank登錄號(hào)為XM_007846773.1)的相似性為81%，E期望值都為2×10-25；BLASTX搜索結(jié)果顯示，所得序列與禾柄銹菌(Pucciniagraminis)26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基6A的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)為XP_003329145.1)和污叉絲孔菌(Dichomitussqualens)26S蛋白酶體亞基P45的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)為XP_007366306.1)相似性都為93%，E期望值都為4×10-28。由此推測(cè)， VNMDF很可能與編碼26S蛋白酶體亞基相關(guān)。

圖5 草菇特異遺傳標(biāo)記VNMDF的序列下劃線(xiàn)處為SCAR250引物對(duì)序列Fig.5 Nucleotide sequence of the specific genetic marker VNMDF of Volvariella volvacea strains Underlined is sequence of SCAR250 primer

2.4 草菇SCAR標(biāo)記的篩選

根據(jù)SRAP擴(kuò)增的特異片段VNMDF的測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)：KJ935906)，設(shè)計(jì)SCAR特異引物對(duì)SCAR250(SCAR250-F：5′-CAAACCGGACCGGAGGAGGG-3′，SCAR250-R：5′-TCTTC-ATTGATGAGCTGGAT-3′)，對(duì)草菇菌絲退化菌株與對(duì)照菌株基因池進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果在菌絲退化草菇菌株基因池中擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為250 bp的單一條帶，而在對(duì)照菌株基因池中未擴(kuò)增出條帶。對(duì)8個(gè)菌絲退化菌株與4個(gè)對(duì)照菌株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示，該引物對(duì)在草菇菌絲退化單株中擴(kuò)增出1條穩(wěn)定的特異條帶，長(zhǎng)度大約為250 bp，與預(yù)期片段大小(279 bp)一致，而對(duì)照菌株中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(圖6)，表明已成功將該SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，將其命名為SCAR250。由于SCAR標(biāo)記在退化菌株中的特異性，推測(cè)獲得的SCAR標(biāo)記可能與草菇菌絲生長(zhǎng)退化性狀連鎖。

圖6 引物標(biāo)記SCAR250在草菇8個(gè)菌絲退化菌株和4個(gè)對(duì)照菌株中的擴(kuò)增結(jié)果1.Marker 1；2～9.菌絲退化菌株VNM；10～13.對(duì)照菌株(V51)Fig.6 Amplification of primer SCAR250 for 8 degenerative strains and 4 CKs of Volvariella volvacea1.Marker 1；2-9.Degenerative strains VNM；10-13.CK (V51)

3 討論與結(jié)論

在草菇的生產(chǎn)實(shí)踐中，菌種退化是制約其產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的一大瓶頸。食用菌菌種退化的本質(zhì)是遺傳變異[3]。草菇菌絲屬初級(jí)同宗結(jié)合真菌，單孢可孕，菌絲細(xì)胞多核。群體分離分析法(Bulked segregation analysis，BSA)是1991年由Michelmore等[31]提出的。本研究在構(gòu)建基因組DNA混合池時(shí)，選擇的草菇菌株(對(duì)照菌株V51和菌絲退化菌株VNM1～10)不但目的性狀表現(xiàn)明顯，且其他性狀基本一致，這樣既有利于篩選到與菌絲退化草菇性狀相關(guān)的DNA差異，又可以節(jié)省時(shí)間，減少工作量。

本研究在對(duì)草菇菌絲退化菌株與對(duì)照菌株基因池進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記SCAR250僅在菌絲退化菌株基因池中有擴(kuò)增片段，對(duì)照菌株基因池中無(wú)擴(kuò)增片段，表明SCAR250標(biāo)記可能是菌絲退化草菇菌株的特異標(biāo)記；隨后進(jìn)行了草菇8個(gè)菌絲退化單株與4個(gè)對(duì)照單株的驗(yàn)證，結(jié)果所有草菇菌絲退化單株都存在SCAR250標(biāo)記，而4個(gè)對(duì)照單株均無(wú)此標(biāo)記，此擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。片段VNMDF是通過(guò)SRAP引物對(duì)Me8-Em4擴(kuò)增而獲得的，特異性很差，檢測(cè)不便，因此在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了SCAR標(biāo)記SCAR250。SCAR標(biāo)記十分穩(wěn)定．在應(yīng)用上具有迅速、簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)[18]。SCAR250標(biāo)記只需對(duì)簡(jiǎn)單提取的草菇總DNA進(jìn)行PCR操作，即可在幾小時(shí)內(nèi)鑒定草菇菌株的類(lèi)型。

進(jìn)一步對(duì)得到的標(biāo)記片段VNMDF進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記與26S蛋白酶體亞基的核酸序列和氨基酸序列相似性較高，分別為81%和93%。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-26S proteasome system，UPS)是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)[32]。它主要由泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白連接酶和26S蛋白酶體組成[33]。它通過(guò)調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)(Turn over)或降解不正常蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。因此，推測(cè)草菇菌絲生長(zhǎng)退化菌株可能是由于編碼26S蛋白酶體亞基的DNA序列發(fā)生突變引起的。

本試驗(yàn)通過(guò)SRAP技術(shù)，對(duì)草菇正常菌株V51與其菌絲退化菌株VNM的基因組DNA進(jìn)行分析，結(jié)果篩選到1條存在于菌絲退化菌株中，且與草菇菌絲退化可能有重大關(guān)聯(lián)的SRAP標(biāo)記，并成功將其轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，該標(biāo)記序列與26S蛋白酶體亞基的核酸序列和氨基酸序列有著很高的相似性，但對(duì)于該標(biāo)記影響草菇菌絲退化的具體機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

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Screening of molecular markers associated with degeneration ofVolvariellavolvaceastrains

LI Dan-qing,WANG Jie

(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgricultureUniversity,Guangzhou,Guangdong510640,China)

【Objective】 The aim of this paper was to screen molecular markers closely linked to hyphae degeneration ofVolvariellavolvaceausing sequence related amplified polymorphism (SRAP) technique and to lay foundation for further cloning and functional analysis of target genes.【Method】 NormalVolvariellavolvaceaV51 strains (CK) and 10 hyphae degenerate strains (VNM) were used to construct isogenic DNA pools by bulked segregation analysis (BAS) method.To find differential fragments between two types of strains,SRAP technique was used.After being recycled,differential fragments were ligated with PMD-18T vector.Then,recombinant plasmids pMD-VNMDF were transformed intoE.coliDH5α competent cells and positive clones were sequenced.Based on the identified fragment sequences,special primers were designed to convert target fragment into sequence-characterized amplification region (SCAR) marker.Amplification tests of normal growth strains V51 and mycelium degradation strains were performed to verify the authenticity and reliability of the marker.【Result】 From 81 pairs of SRAP primer combinations chosen to screen the markers linked to hyphae degeneration of straw mushroom,two could amplify stable different bands.With the primer pairs of Me8-Em4,a polymorphic fragment of 300 bp (named VNMDF) was found in the degenerate strains gene pool.By recycling,sequencing and sequence analysis,it was found that the similarities of nucleic acid sequences and amino acid sequences between the fragment VNMDF and the fragment encoding the 26S proteasome subunits were 81% and 93%,respectively.A fragment of 250 bp was stably amplified by SCAR-specific primers SCAR250 in hyphae degenerate strains,and it was not detected in normal strains.【Conclusion】 In this study,a SRAP marker gene fragment closely linked to straw mushroom hyphae degeneration was obtained and successfully transformed into SCAR marker (SCAR250).

Volvariellavolvacea;strain degeneration;SRAP;SCAR

2014-09-19

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20104404120011)

李丹青(1989-)，男，湖北隨州人，在讀碩士，主要從事食藥用真菌生物技術(shù)研究。E-mail：492847382@qq.com

王 杰(1978-)，女，河南駐馬店人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事食藥用真菌生物工程研究。 E-mail：wjcasey@scau.edu.cn

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.017

Q789；S646.1+3

A

1671-9387(2015)08-0195-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.017.html