華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因DaGSTe1的克隆與表達(dá)

馬俊寧，代魯魯，張然然，陳 輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因DaGSTe1的克隆與表達(dá)

馬俊寧，代魯魯，張然然，陳 輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 克隆華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其序列特征及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，以揭示谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在華山松大小蠹克服寄主抗性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的分子調(diào)控機(jī)制?！痉椒ā?采用RT-PCR和RACE克隆華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)該基因在華山松大小蠹幼蟲、蛹和雌雄成蟲中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 獲得cDNA全長(zhǎng)為973 bp的華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，并命名為DaGSTe1(GenBank登錄號(hào)：KJ637332)，其編碼一個(gè)由218個(gè)氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量約為23.567 ku，理論等電點(diǎn)為7.90。華山松大小蠹DaGSTe1與山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高，達(dá)94%。根據(jù)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的分析推測(cè)，DaGSTe1屬于Epsilon 類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。DaGSTe1蛋白三維結(jié)構(gòu)包括一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域包括典型的4個(gè)β片層和3個(gè)α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3)，C端結(jié)構(gòu)域包括5個(gè)α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在華山松大小蠹不同發(fā)育期均有表達(dá)，其中在雄性成蟲中的表達(dá)量最大，為幼蟲和蛹的8倍，雌性成蟲的4倍。【結(jié)論】 克隆得到了華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族基因DaGSTe1，推測(cè)該基因具有降解寄主毒素的作用，而且參與華山松大小蠹雄性特異性激素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

華山松大小蠹；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；發(fā)育階段

華山松大小蠹(DendroctonusarmandiTsai et Li)是我國(guó)特有的初期性害蟲，主要危害30年以上的健康華山松，嚴(yán)重影響秦嶺巴山林區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展[1]。華山松大小蠹除了在遷飛時(shí)期尋找新的寄主外，其生活史都是在寄主樹木韌皮部?jī)?nèi)部完成的。小蠹科害蟲選擇入侵寄主的過程中，必須克服寄主樹木的組成型(Constitutive)或誘導(dǎo)型(Induced)抗性。針葉樹木分泌的樹脂成分主要包括單萜、倍半萜、二萜和酚類物質(zhì)，這些有毒化合物可以導(dǎo)致小蠹蟲不同器官和組織的損壞，從而使其最終死亡，因此樹脂的分泌在針葉樹寄主防御和抵抗小蠹蟲入侵方面起重要的作用[2-3]。然而小蠹蟲自身具有相應(yīng)的防御機(jī)制來降解有毒化合物，其中細(xì)胞色素P450、酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)這三大類多基因家族酶類的降解作用最為突出[4]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族是一類普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)的一類超家族酶類，能夠轉(zhuǎn)化降解多種天然和人工合成的化合物。昆蟲體內(nèi)包括Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta 和Zeta 6類細(xì)胞質(zhì)GST和1類微粒體(Microsomal)GST，其中Delta和Epsilon家族是昆蟲所特有且被認(rèn)為參與昆蟲解毒反應(yīng)的2個(gè)GST家族，其通過催化內(nèi)源還原性谷胱甘肽(GSH)與各種有害的親電性底物相結(jié)合，并增加有害親電性底物的可溶性，從而使其從細(xì)胞內(nèi)排出，進(jìn)而保護(hù)生物體內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)免受親電基團(tuán)攻擊[5]。此外，GST還具有轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)多種激素物質(zhì)和外源代謝物的作用[6]。到目前為止，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)[7]、家蠅(Muscadomestica)[8]、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)[9]、大劣按蚊(Anophelsdirus)[10]、褐飛虱(Nilaparvatalugens)[11]、德國(guó)小蠊(Blattellagermanica)[12]、小菜蛾(Plutellaxylostella)[13]、紅火蟻(Solenopsisinvicta)[14]和煙草粉虱(Bemisiatabaci)[15]等多種昆蟲中克隆和表達(dá)。小蠹科昆蟲GST基因的研究還僅限于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成的云南縱坑切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)[16]和基因組測(cè)序完成的山松大小蠹(Dendroctonusponderosae)[17]，但對(duì)華山松大小蠹GST基因的克隆與表達(dá)尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究應(yīng)用RT-PCR、RACE和Real time-PCR技術(shù)對(duì)華山松大小蠹GST基因進(jìn)行同源克隆，并檢測(cè)其在不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，旨在揭示谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在華山松大小蠹降解華山松毒素和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的分子調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

華山松大小蠹采自秦嶺火地塘林場(chǎng)內(nèi)的華山松被害木。UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Promega T-easy克隆載體，購(gòu)自北京奧科鼎盛生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、熒光定量PCR試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RACE試劑盒，購(gòu)自Clontech公司。

1.2 華山松大小蠹總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取3只活的華山松大小蠹成蟲，先用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沖洗2次，然后用蒸餾水沖洗1次，放濾紙上干燥后，用液氮研磨充分，加入0.5 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理，然后按照UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明提取華山松大小蠹成蟲總RNA，按PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈。

1.3 華山松大小蠹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(DaGSTe1)全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及序列分析

從GenBank獲取昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Epsilon家族基因的氨基酸序列，用MEGA5比對(duì)后找出保守區(qū)域，用Primer Premier 5.0依據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物GST-F1和GST-R1(表1)，用Touchdown-PCR擴(kuò)增DaGSTe1基因的保守片段。反應(yīng)體系20 μL:TaqMix 10 μL,模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，無菌水8 μL。Touchdown-PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，從58 ℃到48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化，克隆于Promega T-easy載體中，培養(yǎng)后送樣測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。根據(jù)獲得的cDNA片段用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)2對(duì)用于獲得DaGSTe1基因3′和5′端的引物(GST3-F2、GST3-F3，GST5-R2、GST5-R3，表1)。然后根據(jù)Clontech公司RACE試劑盒說明獲取DaGSTe1基因的3′和5′末端序列，將其連接到Promega T-easy 載體中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用Vector NTI 11.5.1拼接出全長(zhǎng)序列，并命名為DaGSTe1?；虻拈_放閱讀框及翻譯的氨基酸由Bioedit 7.0分析得到，翻譯蛋白的分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)由ExPASY軟件預(yù)測(cè)。

1.4 華山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列多重比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及其三維結(jié)構(gòu)模擬

氨基酸序列多重比較由DNAMAN 7.0完成，系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA 5構(gòu)建，翻譯蛋白的三維結(jié)構(gòu)是由Swiss-Model在線服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)生成。

1.5 DaGSTe1基因在華山松大小蠹不同發(fā)育時(shí)期和性別的表達(dá)

用Trizol試劑盒分別提取華山松大小蠹幼蟲、蛹、雌性成蟲和雄性成蟲的總RNA，然后反轉(zhuǎn)成cDNA。以18SRNA為內(nèi)參基因(擴(kuò)增引物為18S-S、18S-A，表1)，采用DaGSTe1的定量PCR引物(GST-S、GST-A，表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitive PCR)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。反應(yīng)體系20 μL:SYBR Premix EXTaq10 μL,模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，無菌水6.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[18]分析定量數(shù)據(jù)，計(jì)算DaGSTe1基因相對(duì)表達(dá)量，用Excel 2007計(jì)算并做圖。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the research

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松大小蠹DaGSTe1基因全長(zhǎng)的克隆及序列分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果(圖1)可知，DaGSTe1基因(GenBank登錄號(hào)KJ637332)cDNA全長(zhǎng)為973 bp，包括一個(gè)654 bp的開放閱讀框， 5′和3′端分別為106和213 bp的非編碼區(qū)。其編碼一個(gè)由218個(gè)氨基酸組成的多肽， ExPASY軟件預(yù)測(cè)翻譯該基因編碼蛋白的分子質(zhì)量約為23.567 ku，理論等電點(diǎn)為7.90。

2.2 華山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列多重比較與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

經(jīng)氨基酸序列多重比對(duì)及SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)搜索，發(fā)現(xiàn)華山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列在第4-77位為較保守的GST N端結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域內(nèi)含GSH結(jié)合位點(diǎn)，而在第86-196位為GST C端結(jié)構(gòu)域，含有疏水底物結(jié)合位點(diǎn)；第70-77位是GST特征序列(圖2)。

由圖3看出，華山松大小蠹DaGSTe1與赤擬谷盜TcGSTe5、家蠶BmGSTe3、家蠅MdGSTe1、黑腹果蠅DmGSTe12、埃及伊蚊AaGSTe2和岡比亞按蚊AgGSTe2同聚在GST Epsilon類。經(jīng)Bioedit 7.0計(jì)算氨基酸序列相似度得出,華山松大小蠹DaGSTe1與山松大小蠹DpGSTe1氨基酸相似度最高，為94%，與其他昆蟲GST Epsilon家族氨基酸相似度高于40%。通常認(rèn)為氨基酸序列相似度高于40%的GST被歸為一類，因此推測(cè)DaGSTe1屬于華山松大小蠹GST Epsilon家族。

圖1 華山松大小蠹DaGSTe1基因全長(zhǎng)序列Fig.1 Full-length sequence of DaGSTe1 gene of Dendroctonus armandi

2.3 華山松大小蠹DaGSTe1蛋白的三維結(jié)構(gòu)模擬

Swiss-Model在線服務(wù)器生成DaGSTe1的成熟蛋白三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖4)表明，DaGSTe1蛋白包括1個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域包括典型的4個(gè)β片層和3個(gè)α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3)，而C端結(jié)構(gòu)域包括5個(gè)α螺旋(α4α5α6α7α8)。

2.4 DaGSTe1在華山松大小蠹不同齡期和性別中的表達(dá)

由圖5可以看出，DaGSTe1在幼蟲和蛹中都有組成型微量表達(dá)；在雌性成蟲中有低量的表達(dá)，表達(dá)量為幼蟲和蛹中的2倍；而在雄性成蟲中DaGSTe1高量表達(dá)，為幼蟲和蛹中表達(dá)量的8倍，為雌性成蟲中表達(dá)量的4倍。

3 結(jié)論與討論

昆蟲GST基因是近年來昆蟲抗藥性以及抗寄主外源毒素研究的熱點(diǎn)，其中Delta和Epsilon家族的GST被大量證實(shí)是參與昆蟲抗殺蟲劑和寄主毒素最重要的GST類群[19-20]。

在鞘翅目昆蟲中，赤擬谷盜和山松大小蠹基因組中分別有41個(gè)和28個(gè)GST基因，其中GST Epsilon基因分別有19個(gè)[21]和12個(gè)[17]，但都還沒有進(jìn)行相關(guān)功能分析。在研究較為成熟的雙翅目和鱗翅目昆蟲中，埃及伊蚊AaGSTe2和岡比亞按蚊AgGSTe2具有代謝DDT、有機(jī)磷農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的作用[22]；黑腹果蠅DmGSTe6和DmGSTe7基因具有代謝甲基對(duì)硫磷作用,但DmGSTe3則無代謝甲基對(duì)硫磷作用[23]；家蠶GST Epsilon 家族具有過氧化酶活性和抗氧化壓力的功能[24-25]。本研究通過同源克隆方法，獲得1個(gè)華山松大小蠹GST Epsilon家族基因，并命名為DaGSTe1，該基因編碼一個(gè)由218個(gè)氨基酸組成的多肽，這與大多數(shù)昆蟲細(xì)胞質(zhì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因編碼200～250個(gè)氨基酸多肽的結(jié)論相似。同源氨基酸比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果都證實(shí)了華山松大小蠹DaGSTe1屬于GST Epsilon家族，且與赤擬谷盜TcGSTe5同源性最高，這也與昆蟲的分類地位相一致。鑒于DaGSTe1與進(jìn)行了功能分析的家蠶BmGSTe3[25]有較高同源性，推測(cè)DaGSTe1有抗氧化壓力和過氧化物酶的作用。

圖2 華山松大小蠹DaGSTe1與其他昆蟲GST Epsilon類氨基酸序列的多重比較黑色陰影表示100%相似度區(qū)域；深灰色陰影表示≥75%相似度區(qū)域；淺灰色陰影表示≥50%相似度區(qū)域；實(shí)線方框區(qū)域?yàn)镈aGSTe1 N端結(jié)構(gòu)域；虛線方框?yàn)镈aGSTe1 C端結(jié)構(gòu)域；實(shí)線下劃線處為GST特征序列；虛線下劃線處為GST Epsilon 特征序列。 DaGSTe1.華山松大小蠹(KJ637332)；AaGSTe2.埃及伊蚊(AAV68398)；AgGSTe2.岡比亞按蚊(2IL3)；BmGSTe3.家蠶(NP_001108466)；DmGSTe12.黑腹果蠅(AAF47266)；MdGSTe1.家蠅(3VWX)；TcGSTe5.赤擬谷盜(XP_967395)Fig.2 Multiple alignment of Dendroctonus armandi DaGSTe1 with Epsilon class GST in other insectsBlack shadow indicates 100% homology region;dark grey shadow indicates the region with more than 75% homology;light grey shadow indicates the region with more than 50% homology;solid line box region is DaGSTe1 N-terminal domain;dash line box region is DaGSTe1 C-terminal domain;the sequence underlined with solid line is the characteristic motif of GST;the sequence underlined with dash line is characteristic motif of Epsilon GST.DaGSTe1.Dendroctonus armandi (KJ637332);AaGSTe2.Aedes aegypti (AAV68398);AgGSTe2.Anopheles gambiae (2IL3);DmGSTe3.Bombyx mori (NP_001108466); DmGSTe12.Drosophila melanogaster (AAF47266);MdGSTe1.Musca domestica (3VWX); TcGSTe5.Tribolium castaneum (XP_967395)

本研究的華山松大小蠹DaGSTe1蛋白模擬三維結(jié)構(gòu)與美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、煙草天蛾(Manducasexta)的GST Delta和Epsilon 家族蛋白三維結(jié)構(gòu)類似，都包含1個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域由α螺旋和β片層構(gòu)成，為谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合區(qū)域，通常這部分區(qū)域高度保守。在哺乳動(dòng)物結(jié)合區(qū)域中酪氨酸負(fù)責(zé)激活谷胱巰基殘基，而在昆蟲中則由Delta和Epsilon家族谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶中的絲氨酸承擔(dān)。華山松大小蠹DaGSTe1的C端結(jié)構(gòu)域全部由α螺旋構(gòu)成，作為識(shí)別并結(jié)合疏水性的輔助底物，且該結(jié)構(gòu)域氨基酸序列不保守[26]。

圖3 構(gòu)建的華山松大小蠹DaGSTe1與其他昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of DaGSTe1 of Dendroctonus armandi with GST from other insects

圖4 華山松大小蠹DaGSTe1的三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three dimensional structure of DaGSTe1 of Dendroctonus armandi

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DaGSTe1基因在華山松大小蠹不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DaGSTe1基因在華山松大小蠹各發(fā)育期均有表達(dá)，推測(cè)DaGSTe1基因參與幼蟲、蛹和雌雄成蟲體內(nèi)的解毒過程，即催化谷胱甘肽與華山松萜烯類和酚類物質(zhì)結(jié)合，使有毒物質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，從而降低寄主外源毒素對(duì)華山松大小蠹的傷害[27]。但DaGSTe1基因在雄性成蟲中的高量表達(dá)，說明該基因除了具有降解外源毒素的作用外，還可能參與性別專一的華山松大小蠹信息素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

Feng等[28]通過對(duì)云杉卷葉蛾(Choristoneurafumiferana)不同殺蟲劑處理下GST基因表達(dá)的分析認(rèn)為，GST不僅具有降解外源毒素的作用，而且在轉(zhuǎn)運(yùn)云杉卷葉蛾蛻皮激素的過程中也發(fā)揮重要作用。此外，Strode等[29]發(fā)現(xiàn)，岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)GST基因在非進(jìn)食期的高量表達(dá)，推測(cè)其具有調(diào)節(jié)昆蟲生理方面的作用。本研究通過RT-PCR、RACE技術(shù)得到了華山松大小蠹DaGSTe1的序列全長(zhǎng)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)DaGSTe1基因在華山松大小蠹不同發(fā)育時(shí)期和性別中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步明確華山松大小蠹GST在抵抗華山松樹脂毒素以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的分子調(diào)控作用提供了重要價(jià)值。

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Cloning and expression of glutathione S-transferase geneDaGSTe1 ofDendroctonusarmandi

MA Jun-ning,DAI Lu-lu,ZHANG Ran-ran,CHEN Hui

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The research was conducted to clone glutathione S-transferase (GST) gene inDendroctonusarmandiand analyzed its sequence features and expression at four developmental stages for demonstrating the molecular mechanism ofD.armandiGST in resisting phytotoxins and transporting hormones.【Method】 RT-PCR and RACE were employed to cloneDaGSTe1 gene and real-time PCR was utilized to examine theDaGSTe1 expression patterns at different developmental stages.【Result】 Glutathione S-transferase gene with cDNA of 973 bp was isolated fromD.armandiand named DaGSTe1 with GenBank accession number of KJ637332.It encoded a protein of 218 amino acid residues with predicted molecular weight of 23.567 ku and isoelectric point of 7.90.DaGSTe1 shared 94% identity with DpGSTe1.The protein homology demonstrated that the predicted protein structure of DaGSTe1 was similar to GST Epsilon members,with an N domain (β1α1β2α2β3β4α3) and a C domain (α4α5α6α7α8).Gene expression patterns at different developmental stages illustrated thatDaGsSTe1 was expressed at all developmental stages,but was only expressed at high quantity in male adult,which was eight times of that at larvae and pupae stages and four times of that in female adult.【Conclusion】DaGSTe1 was successfully cloned and was predicted to play a dual role in detoxification of host allele chemicals and transport of male-specific hormones.

Dendroctonusarmandi;glutathione S-transferase;gene cloning;developmental stage

2014-02-04

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004077)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170607)；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(IRT1035)

馬俊寧(1988-),男，河南三門峽人，碩士，主要從事森林昆蟲研究。 E-mail:mjn404@nwuaf.edu.cn

陳 輝(1961-),男，甘肅酒泉人，教授，主要從事森林昆蟲研究。 E-mail:chenhui@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.005

Q78；S763.38

A

1671-9387(2015)08-0116-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.005.html