羅漢果新病害斑枯病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選

蔣 妮, 胡鳳云, 葉云峰, 蔣水元, 黃汐洋

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,桂林 541006;2.廣西藥用植物園,南寧 530023)

羅漢果新病害斑枯病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選

蔣 妮1,2, 胡鳳云2, 葉云峰2, 蔣水元1*, 黃汐洋1

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,桂林 541006;2.廣西藥用植物園,南寧 530023)

為明確羅漢果新病害斑枯病的病原菌種類并篩選出有效的防治藥劑,采用組織分離法分離病原菌并通過柯赫氏法則驗證其致病性,根據(jù)菌落特征、菌株形態(tài)及ITS序列分析進行病原菌的鑒定;采用生長速率法測定了12種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)抑制活性。結(jié)果表明,羅漢果新病害的病原菌為Stagonosporopsis cucurbitacearum;供試的藥劑中,60%咪鮮胺錳鹽WP(0.5 g/L)、80%戊唑醇WP(0.25 g/L)、45%甲霜·惡霉靈WP(1 g/L)、60%唑醚·代森聯(lián)WP (0.5 g/L)室內(nèi)對該菌菌絲的抑制率均達100%,可進一步進行大田藥效試驗,將藥效好的藥劑推薦田間使用。

羅漢果; 斑枯病; 病原鑒定; 藥劑篩選

羅漢果[Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey ex A M Lu&Zhi Y Zhang]屬葫蘆科多年生藤本植物,果實藥用,性涼味甘,具有抗菌消炎、潤肺止咳等功效,是廣西大宗道地藥材,主要在桂北地區(qū)種植[1]。羅漢果人工栽培時間較長,病害發(fā)生種類多且危害嚴(yán)重,據(jù)文獻報道羅漢果地上部分發(fā)生的病害主要有病毒病、皰葉叢枝病、炭疽病、青枯病及生理性芽枯病[2-8]。危害羅漢果地上部分的病毒病和皰葉叢枝病主要由病毒引起,葉片主要表現(xiàn)出花葉、黃化、畸形等病毒典型癥狀;青枯病主要由細(xì)菌引起,主要表現(xiàn)為整株失水、青枯;生理性芽枯病主要由于土壤缺硼引起,主要表現(xiàn)在新抽嫩芽、嫩梢枯萎;炭疽病主要是由炭疽菌引起果實腐爛、落果,也可危害葉片,病斑黃色至黃褐色,邊緣褐色,圓形,中央淡灰色。近年來隨著羅漢果品種選育的不斷推進,無籽羅漢果開始在桂林等地推廣種植,在此過程中我們發(fā)現(xiàn)一種危害羅漢果葉片的病害,該病害的田間癥狀主要表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)多個黃褐色小斑點,且病斑周圍葉片組織大范圍地褪綠變黃色,發(fā)生后期葉片呈黃褐色,枯萎,與羅漢果現(xiàn)有病害的癥狀均不一致,暫稱之為羅漢果斑枯病。據(jù)筆者田間調(diào)查植株發(fā)病率為84.0%,病葉率為42.46%,屬嚴(yán)重發(fā)生的病害,且尚未有研究報道,為此開展了病原菌的分離鑒定及藥劑篩選工作,為該病害的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2013年9月在廣西桂林市雁山鎮(zhèn),采集無籽羅漢果植株上具有典型癥狀的病葉以及健康葉片各50份。試驗藥劑為市售的唑醚·代森聯(lián)等12種殺菌劑(見表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病菌株的分離

采用常規(guī)組織分離法分離致病菌[9]：用清水將采集的病葉洗凈,剪取數(shù)塊長、寬分別為4 mm× 4 mm的病葉組織,用75%的乙醇處理30 s,0.1%升汞消毒2～3 min,無菌水沖洗3遍,接種在PDA培養(yǎng)基上,28℃下培養(yǎng)5 d,將分離到的菌株純化后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定

將純化的菌株接種至PDA培養(yǎng)基,在28℃、濕度為65%的珠江牌光照培養(yǎng)箱(韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械廠,RH -550-Gb型)內(nèi)培養(yǎng)5 d,用打孔器制成直徑為6 mm的菌片備用。采取針刺與無傷接種兩種方式進行。用無菌接種針在健康的羅漢果葉片上刺成若干傷口,用接種鏟將菌片接至傷口;無傷接種則直接將菌片接至健康葉片上,以接種PDA培養(yǎng)基作為對照,接種后在28℃條件下保濕培養(yǎng),每24 h觀察、記錄發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則,對發(fā)病葉片進行再分離、培養(yǎng),顯微鏡下觀察分離得到的菌株是否與原接種菌株相同[9]。

1.2.3 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：該菌在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢,故將致病菌株移至PDA平板上28℃下培養(yǎng)5 d后,接種至黃瓜上誘導(dǎo)其產(chǎn)生有性階段,觀察記錄菌落特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)[9],并以菌落形態(tài)、病害的癥狀為參考依據(jù)初步鑒定病原菌種屬。

分子鑒定：采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA[10]。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') (上海捷瑞生物工程有限公司合成),擴增該菌的rDNA-ITS序列。擴增產(chǎn)物的純化和序列測定委托北京諾賽生物科技有限公司進行,所得到的核苷酸序列與GenBank中相關(guān)菌株進行同源性比較[11]。

1.2.4 殺菌劑對病原菌的抑制活性測定

采用菌絲生長速率法測定供試藥劑對病菌菌絲生長的抑制活性[12]。供試藥劑濃度參照生產(chǎn)商推薦的使用濃度來確定(表1)。將配制好的供試藥劑母液按照設(shè)定的濃度比例加入到已融化并冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中,充分混勻后分別倒入直徑為120 mm的滅菌培養(yǎng)皿中,制成含藥平板,以不加藥劑但含等量溶劑的PDA平板為對照,各處理重復(fù)3次。用直徑為9 mm的打孔器在預(yù)培養(yǎng)的菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅,接種到含藥培養(yǎng)基平板中央,置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 d,用十字交叉法測量各處理的菌落直徑,并求出3次重復(fù)的平均值,用下述公式計算抑制率：

菌落擴展直徑(mm)=菌落的平均擴展直徑-9 (菌餅直徑);

相對抑制率(%)=(對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑)/對照菌落擴展直徑×100。

表1 供試藥劑名稱及其產(chǎn)地、使用濃度Table 1 Tested fungicides and their different concentrations used in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SAS軟件對試驗的原始數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查

田間癥狀：該病多發(fā)生在羅漢果的嫩葉上,發(fā)病初期在葉尖、葉緣、葉中均可出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形的黃褐色小斑點,且在病斑周圍有明顯的黃色暈斑包圍,病健交界明顯(圖1a),隨著病情的蔓延發(fā)展擴大成中央黃白色的黃褐色不規(guī)則大斑,病斑中央略凹陷,部分開裂,后期多個大病斑連起來,導(dǎo)致葉片枯萎(圖1b)。

圖1 羅漢果葉片發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms on Siraitia grosvenorii leaves

2.2 致病性測定

接種葉片在28℃下保濕培養(yǎng)24 h后,針刺接種的葉片表現(xiàn)出受害狀,病斑初為斑點狀,逐漸擴展成圓形或不規(guī)則黃褐色大斑,且由于溫濕度條件好,生長旺盛,后期葉片正反面都布滿了菌絲(圖2a～b),接種5 d后病原菌侵染整張葉片。無傷接種的葉片在保濕48 h后,也出現(xiàn)針尖大小的斑點,接種7 d后侵染整張葉片。對照葉片未見發(fā)病。從發(fā)病葉片上再分離到的病原菌與原接種菌株相同,證實了原接種菌株為致病菌。該病原菌可以不通過傷口侵染寄主,但有傷口的寄主組織有利于病原菌的入侵。

圖2 病原菌對羅漢果葉的致病性測定Fig.2 Pathogenicity assays of the pathogen isolated from diseased Siraitia grosvenorii leaves

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長良好但不產(chǎn)孢, 28℃下培養(yǎng)10 d,直徑達90 mm,日均生長速度為9.0 mm。菌落(圖3a～b)致密、白色、圓形、邊緣整齊,菌落正面以接種點為圓心形成波浪狀輪紋,菌落背面為墨綠色波浪狀輪紋;菌絲緊貼平皿生長,前期白色后期轉(zhuǎn)為灰白色、密集、絨氈型。經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生子囊殼,在顯微鏡下觀察到子囊殼球形至近球形,直徑80～120μm;子囊(圖3c)束生,圓筒形至棍棒形,大小(45～70)μm×(14～28)μm,雙囊壁,內(nèi)含8個子囊孢子;有絲狀假側(cè)絲;子囊孢子無色,近梭形,中間具隔膜1個,大小(18～40)μm×(8～12)μm。該病原菌的形態(tài)特征與Silva[13]等描述的Stagonosporopsis cucurbitacearum的形態(tài)特征相似,屬子囊菌亞門真菌。

圖3 Stagonosporopsis cucurbitacearum病原菌形態(tài)Fig.3 Morphology of Stagonosporopsis cucurbitacearum

2.4 病原菌分子鑒定

采用通用引物ITS4/ITS5對羅漢果斑枯病菌菌株的r DNA-ITS序列進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到大小約為600 bp的片段,經(jīng)序列測定,該片段全長554 bp(圖4)(Gen-Bank登錄號為KM216012)。將上述測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比對,該菌株與S.cucurbitacearum(GenBank登錄號為KF386611.1)的同源性達99%。初步鑒定該病原菌為Stagonosporopsis cucurbitacearum。

圖4 病原菌rDNA-ITS片段序列Fig.4 rDNA-ITSsequence from pathogen

2.5 殺菌劑對病原菌的抑制活性

結(jié)果如表2所示。在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d, 45%甲霜·惡霉靈WP、80%戊唑醇WP、60%咪鮮胺錳鹽WP、60%唑醚·代森聯(lián)WP對病原菌的抑制率均為100%,表現(xiàn)出穩(wěn)定、極強的抑制作用; 15%苯醚·咪鮮胺EC藥后6 d對病原菌的抑制率為94.76%,藥后12 d抑制率為95.74%,抑制活性強且穩(wěn)定;10%苯醚甲環(huán)唑WG、250 g/L吡唑醚菌酯EC、65%多抗·陽光霉素WP藥后6、12 d抑制率均為80%～90%,表現(xiàn)出較強的抑制作用;250 g/L丙環(huán)唑EC、80%代森錳鋅WP藥后6、12 d抑制率為60%～70%,對病原菌的抑制作用較差;70%甲基硫菌靈WP、72%霜脲·錳鋅WP抑制率均降至40%以下,其中70%甲基硫菌靈WP的抑制率為11.57%,基本無抑制作用?？蛇M一步進行大田藥效試驗,將田間藥效好的藥劑提供生產(chǎn)使用。

表2 各供試藥劑對Stagonosporopsis cucurbitacearum的抑制效果1)Table 2 Inhibitory effects of the tested fungicides on mycelial growth of Stagonosporopsis cucurbitacearum

3 小結(jié)與討論

新病害—斑枯病在桂林市嚴(yán)重危害無籽羅漢果葉片,在廣西藥用植物園試驗地中種植的傳統(tǒng)羅漢果植株上也可看到相同癥狀,經(jīng)分離回接及分子鑒定初步明確了分離到的致病菌為S.cucurbitacearum,屬子囊菌。經(jīng)文獻檢索,目前國內(nèi)尚未有以S.cucurbitacearum命名的植物病原菌的報道,僅有一篇文獻報道了該菌為從甘肅棘豆中分離出的一種內(nèi)生真菌[14]。國外Haga等報道該菌是一種海洋真菌,并從中分離得到對白色念珠菌抑制效果較好的活性物質(zhì)[15];巴西的Silva等在2013年報道該菌侵染絲瓜果實,導(dǎo)致絲瓜腐爛[13]。2010年Aveskamp等[16]發(fā)表了關(guān)于莖點霉屬真菌種、屬特征及命名的論文,將Sphaeria cucurbitacearum, Didymella bryonia e,Phoma cucurbitacearum視為S.cucurbitacearum的異名。據(jù)文獻檢索,Sphaeria cucurbitacearum,Didymella bryoniae,Phoma cucurbitacearum可侵染黃瓜、西瓜、苦瓜、南瓜、甜瓜、葫蘆等多種葫蘆科植物,但尚未有侵染羅漢果的研究報道。子囊菌的無性繁殖能力強,在自然界經(jīng)常看到的是它們的無性階段,田間侵染寄主植物多為無性型[17],本試驗直接從寄主植物上分離、培養(yǎng)到子囊菌,并經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了子囊孢子。為此,筆者認(rèn)為由S.cucurbitacearum引起的羅漢果斑枯病為羅漢果上發(fā)生的一種新病害。

室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明60%咪鮮胺錳鹽WP、80%戊唑醇WP、45%甲霜·惡霉靈WP、60%唑醚·代森聯(lián)WP對S.cucurbitacearum菌絲有很強的抑制效果。據(jù)郝永娟、郝敬喆等[1819]報道,咪鮮胺、惡霉靈、戊唑醇、唑醚·代森聯(lián)等藥劑對由Didymella bryoniae(S.cucurbitacearum的異名)引起的瓜類蔓枯病都具有較好的抑制效果,抑制率為70%～90%,而本試驗發(fā)現(xiàn)咪鮮胺錳鹽、甲霜·惡霉靈對該菌的抑制率達100%,可進一步進行田間藥效試驗,將防效好的藥劑作為田間使用的推薦藥劑。

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(責(zé)任編輯：王 音)

Pathogen identification of a new disease in Siraitia grosvenorii and screening of effective fungicides

Jiang Ni1,2, Hu Fengyun2, Ye Yunfeng2, Jiang Shuiyuan1, Huang Xiyang1

(1.Guangxi Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006,China; 2.Guangxi Botanical Garden of Medicine Plant,Nanning 530023,China)

A new disease in Siraitia grosvenorii occurred seriously in producing area of Guangxi.The fungus was isolated from infected plants according to Koch’s Rule.Based on morphological characters and molecular analysis of internal transcribed spacer(ITS)sequences,the pathogen was identified to be Stagonosporopsis cucurbitacearum.Antimicrobial activity of 12 fungicides by mycelial growth rate method indicated that 60%prochlorazmanganese chloride complex WP(0.5 g/L),80%tebuconazole WP(0.25 g/L),45%metalaxyl·hymexazol WP (1 g/L)and the 60%pyraclostrobin·metiram WP(0.5 g/L)had strong antimicrobial effects,with the inhibitory ratio of 100%.This is the first report of S.cucurbitacearum infecting S.grosvenorii worldwide.The fungicides should be further tested in the field to control the new disease.

Siraitia grosvenorii; spot blight; pathogen identification; screening of fungicides

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.032

2014-09-19

2014-12-04

國家科技支撐計劃項目(2011BAI01B03);廣西科技攻關(guān)項目(1355001-2-6,14124002-9);廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFC018022)

*通信作者 E-mail：jsy@gxib.cn