兩種人工接種方法鑒定RNA干涉介導的轉(zhuǎn)基因玉米對矮花葉病的抗性

李燕萍, 李 磊, 張志勇, 沈小娟, 李晚忱, 付鳳玲

(四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所,成都 611130)

兩種人工接種方法鑒定RNA干涉介導的轉(zhuǎn)基因玉米對矮花葉病的抗性

李燕萍, 李 磊, 張志勇, 沈小娟, 李晚忱*, 付鳳玲

(四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所,成都 611130)

本研究采用兩種人工接種方法,以玉米成株期病情指數(shù)為指標,鑒定了63個轉(zhuǎn)基因玉米株系的田間抗病性。結(jié)果表明,T4代轉(zhuǎn)化株系‘47’和‘13h2-3’的抗病性達R抗級,超過抗病對照‘H9-21’。有82.5%(52/63)的轉(zhuǎn)基因株系抗病性比未轉(zhuǎn)化對照顯著提高,表明用反向重復的RNA干涉表達載體轉(zhuǎn)化玉米,可獲得轉(zhuǎn)基因抗病毒材料,且干涉片段適度延長可增加獲得抗病材料的幾率。另外,本文通過兩種病毒接種方法的比較,發(fā)現(xiàn)采用玻璃纖維刷苗床穿刺接種比常規(guī)石英砂摩擦接種具有更小的誤差。

玉米; RNA干涉; 轉(zhuǎn)基因; 矮花葉病毒; 抗病性

玉米矮花葉病發(fā)生范圍廣泛,危害程度嚴重,是玉米主產(chǎn)區(qū)的重要病害之一[1]。近年來,隨著易感品種的大面積推廣和耕地復種指數(shù)的提高,玉米矮花葉病已從何廣達等[2]劃分的有病區(qū)擴展到無病區(qū),從零星發(fā)生發(fā)展為連片暴發(fā)。柴淑艷報道,自2009年以來,山西襄汾縣夏播玉米田,累計發(fā)病面積達3.33萬hm2,占夏播面積的50%,發(fā)病株率平均46.7%,最高達到90%以上,最低25%,受害田塊減產(chǎn)50%～60%[3]。王攀等調(diào)查了陜西涇陽三渠鎮(zhèn)2013年的春播玉米,發(fā)現(xiàn)矮花葉病病田率達91.7%,平均病株率70%以上田塊占58%[4]。

研究表明,侵染我國玉米主產(chǎn)區(qū)的病毒毒源主要是甘蔗花葉病毒(SCMV)和玉米矮花葉病毒(MDMV)B株系[5-8],而研究表明,MDMV-B可劃歸于SCMV病毒類型,因此,引起我國玉米矮花葉病的毒源主要是SCMV[9-13]。

玉米矮花葉病主要通過媒介蚜蟲傳播,病害防治除及時控制蚜蟲數(shù)量和加強田間管理外,培育抗病品種是防治病害的根本途徑。隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展和對RNA干涉原理的深入理解,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗病材料進而培育抗病品種已成為可能[116]。

前期研究中,我們利用RNA干涉原理,針對SCMV病毒外殼蛋白(CP)基因和蛋白酶(P1)基因的保守序列,構(gòu)建了不同長度片段具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA干涉表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法和玉米芽尖法轉(zhuǎn)化玉米自交系‘18-599紅’的胚性愈傷和‘18-599白’的芽尖組織,經(jīng)自交繁育和PCR檢測,獲得了63個遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因玉米株系[1718]。本研究旨在對獲得的轉(zhuǎn)基因株系進行田間抗病性鑒定和評價,為轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米品種培育提供抗性資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

前人研究表明,RNA干涉片段的長短影響其對病毒的干涉效率。因此前期研究中,筆者針對矮花葉病毒cp和p 1基因不同長度干涉片段構(gòu)建了多個RNA干涉表達載體[17-18],分別用農(nóng)桿菌介導法和玉米芽尖法轉(zhuǎn)化自交系‘18-599紅’和‘18-599白’,套袋自交結(jié)合PCR檢測獲得遺傳穩(wěn)定的T4～T5代轉(zhuǎn)化株系。具體信息見表1。

表1 玉米轉(zhuǎn)基因株系名錄1)Table 1 Name of transgenic lines in maize

在抗病鑒定中,以自交系‘H9-21’為抗病對照,‘Mo17’為感病對照,‘18-599紅’、‘18-599白’為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。用于接種的病毒來自西北農(nóng)林科技大學吳云鋒教授實驗室保存的玉米病葉,經(jīng)感病自交系‘Mo17’復壯擴繁,取典型病葉-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 田間試驗設(shè)計

1.2.1 愈傷組織轉(zhuǎn)化法得到的轉(zhuǎn)基因T4代株系抗矮花葉病鑒定

T4代20個陽性株系種植在溫江和雅安兩地具有隔離墻的試驗地,隨機區(qū)組設(shè)計,2次重復,單行區(qū),株行距為60 cm×80 cm,雙株種植,每行14株,病毒采用石英砂摩擦法接種,具體見1.3。

1.2.2 愈傷組織轉(zhuǎn)化法得到的轉(zhuǎn)基因T5代株系抗矮花葉病鑒定

T5代22個陽性株系種植在雅安濆江農(nóng)場和雅安農(nóng)科所試驗地,種植期與普通玉米間隔35 d,田間試驗設(shè)計同1.2.1,病毒接種方法采用人工苗床結(jié)合玻璃纖維刷穿刺接種,具體接種方法見1.3。

1.2.3 芽尖轉(zhuǎn)化法得到的轉(zhuǎn)基因T4代株系抗矮花葉病鑒定

芽尖法獲得的T4代21個陽性株系種植在雅安濆江農(nóng)場和雅安農(nóng)科所試驗地,種植方法、試驗設(shè)計及病毒接種方法同田間試驗設(shè)計1.2.2。

以上田間試驗均在抽雄期調(diào)查各供試材料的病情指數(shù)和抗病性,具體指標和標準見1.4。

1.3 兩種病毒接種方法

玉米矮花葉病抗性鑒定,傳統(tǒng)方法是采用金剛砂(或石英砂)摩擦接種法[19]。但在試驗中發(fā)現(xiàn)這種接種方法因人為用力的不一致而造成較大的接種誤差,因此本研究增加了人工苗床結(jié)合玻璃纖維刷穿刺法接種病毒,并對兩種方法進行比較,試圖提高接種效率并減少接種誤差。

稱取玉米矮花葉病典型病葉,用液氮研磨,然后用PBS緩沖液(NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/ L,Na2HPO410 mmol/L,KH2PO42 mmol/L)懸浮,質(zhì)量體積比約為1%～2%,備用。

1)石英砂摩擦接種法：供試玉米材料生長至3～4葉期,將石英砂按玉米抗矮花葉病鑒定技術(shù)規(guī)范[19]加入到待接種病毒懸浮液中,用毛筆蘸取病毒懸浮液刷拭心葉下第一、第二葉基部,拇指和食指從葉基捋向葉尖,一周內(nèi)重復接種2次,抽雄期進行抗病性鑒定。

2)人工苗床結(jié)合玻璃纖維刷穿刺接種法：將供試玉米材料播種于人工苗床,生長至3～4葉期,將病毒懸浮液用噴壺均勻噴霧于植株葉面,再用玻璃纖維刷(直徑6μm)均勻地輕扎葉片若干次,在葉面造成微傷,最后再全面噴灑1次病毒懸浮液,一周后移栽大田,抽雄期調(diào)查其抗病性。

1.4 抗病性鑒定方法

根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第4部分：玉米抗矮花葉病鑒定技術(shù)規(guī)范》[19],在玉米進入抽雄期時記錄癥狀級別,計算病情指數(shù),并由此對田間成株期玉米進行抗性鑒定和評價。具體癥狀分級標準見表2,抗病級別依據(jù)病情指數(shù)按表3標準進行分級。病情指數(shù)計算按下式進行：

式中：DI為病情指數(shù);N為病害某一級別的植株數(shù); R為某級別的相應病級數(shù)值;M為病害的最高病級數(shù)值;T為調(diào)查總株數(shù)。

表2 玉米成株期矮花葉病癥狀級別劃分Table 2 Symptom grading standard of maize dwarf mosaic disease at maize adult stage

表3 玉米矮花葉病的抗性評價標準Table 3 Resistance evaluation standard of maize dwarf mosaic disease

1.5 相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

將2種病毒接種方法、3個轉(zhuǎn)基因世代的病情指數(shù),利用SPSS統(tǒng)計軟件進行株系間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種病毒接種方法的比較

取自交系‘18-599紅’4葉期同葉位新鮮葉3片,其中1片葉用噴壺噴灑PBS緩沖液,再用玻璃纖維刷輕扎葉片若干次(圖1a),1片葉撒上少量石英砂,毛筆蘸取PBS緩沖液,在葉面上定向輕輕摩擦3次(圖1b);第3片不做任何處理(圖1c)。將處理好的3片葉置于倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)玻璃纖維刷穿刺法對葉片造成的傷口小,而且在葉面上呈均勻的散點狀分布,有利于SCMV侵染活的宿主細胞,提高病毒侵染的成功率。而石英砂摩擦法對葉片造成的損傷面積大,呈連片狀分布,而且不均勻,不利于病毒侵染,也會造成較大的接種誤差。顯微觀察結(jié)果見圖1。

選取愈傷組織轉(zhuǎn)化得到的T4(采用石英砂摩擦法接種)和T5(采用玻璃纖維刷接穿刺接種)代株系在雅安濆江農(nóng)場的病情指數(shù)數(shù)據(jù),構(gòu)建新的隨機區(qū)組資料(表4),比較2種接種方法的優(yōu)劣。

圖1 倒置顯微鏡下觀察兩種接種方法對玉米葉片造成的損傷Fig.1 Microscopic observation of the injury to maize blades by two inoculation methods

表4 兩種接種方法接種后玉米病情指數(shù)比較(雅安濆江農(nóng)場)Table 4 The disease index comparison of two inoculation methods with SCMV

結(jié)果表明,石英砂接種法接種的植株病情指數(shù)平均值極差36.11、標準差11.85、變異系數(shù)15.93%;玻璃纖維刷法接種的植株病情指數(shù)平均值極差70.01、標準差17.93、變異系數(shù)33.95%。表明用石英砂法對各株系接種,病情指數(shù)變異小,不容易發(fā)現(xiàn)株系間的差異顯著性;而玻璃纖維刷接種,病情指數(shù)變異大,易于發(fā)現(xiàn)各株系間的差異顯著性。再從抗病對照自交系‘H9-21’兩個區(qū)組的平均病情指數(shù)看,石英砂法為88.27,與感病對照自交系‘Mo17’的平均病情指數(shù)85.30幾乎沒有區(qū)別;而玻璃纖維刷法抗病與感病自交系病情指數(shù)差異明顯,符合生產(chǎn)實際情況。

綜上表明,玻璃纖維刷穿刺接種法采用直徑6μm玻璃纖維穿刺玉米葉片,更能模擬蚜蟲口針以刺吸方式傳播SCMV的過程,加之對葉片損傷小而且損傷均勻分布,因此操作誤差小,易于鑒別各株系的抗病性。

2.2 各株系抗病性比較

用SPSS軟件的“一般線性模型”中“單變量”模塊對各株系兩地病情指數(shù)(愈傷組織T4株系因雅安數(shù)據(jù)失真,只用溫江一地數(shù)據(jù)分析)進行隨機區(qū)組資料的方差分析,再選擇0.05顯著水平下用Duncan法對供試株系的病情指數(shù)進行多重比較,結(jié)果見表5。屬于抗性級別(R)的有從愈傷組織轉(zhuǎn)化得到T4株系的‘47’和‘13h2-3’,外源基因分別為C404和P150,其抗性級別高于抗病對照‘H9-21’,三者的病情指數(shù)無顯著差異;屬于中抗級別(MR)的有轉(zhuǎn)化愈傷組織獲得的T4株系‘8(下)’等7個株系,其抗性級別與抗病對照‘H9-21’相同;轉(zhuǎn)化愈傷組織獲得的T5代‘68’、‘52B’2個株系,抗性級別低于‘H9-21’,其病情指數(shù)與‘H9-21’無顯著差異;轉(zhuǎn)化芽尖組織獲得的T4代株系中的‘SL-13-4’等4個株系,抗性級別顯著低于‘H9-21’。上述13個劃歸為中抗(MR)級別的株系中,來自外源基因C100的1個、P150的2個、C404的6個、P451的4個。上述分析表明,RNA干涉片段越長,抗性株系產(chǎn)生的機會越多。

與未轉(zhuǎn)化自交系‘18-599紅’、‘18-599白’及感病對照‘Mo17’(抗性級別為高感HS)相比,絕大部分轉(zhuǎn)基因株系抗病性得到顯著提高(52/63=82.5%),抗性為感病(S)以上級別。表明采用RNA干涉轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以明顯提高玉米自交系對矮花葉病的抗病性。

表5 各株系病情指數(shù)及抗性評價1)Table 5 Disease index of transgenic lines and the resistance evaluation

3 討論

3.1 一種新型玉米矮花葉病毒接種方法的可行性

1989年,林肯恕提出了經(jīng)典的石英砂人工摩擦接種玉米矮花葉病毒的方法進行抗病性鑒定[20];并且在后來的幾十年有關(guān)該病的抗性研究中,人工接種病毒一直采用此法;直到2006年,國家農(nóng)業(yè)部以此法為基礎(chǔ),用技術(shù)規(guī)范的形式將其正式固定下來。在應用于農(nóng)業(yè)研究的幾十年中,該法在篩選優(yōu)質(zhì)的抗矮花葉病玉米種質(zhì)資源和抗病玉米的常規(guī)雜交育種中發(fā)揮了不可替代的作用。但在筆者近年來對轉(zhuǎn)基因材料的接種試驗中,發(fā)現(xiàn)該法嚴重依賴接種者的操作經(jīng)驗和技巧,容易出現(xiàn)以下問題：

(1)易造成葉肉細胞損傷。眾所周知,病毒只有侵染活的宿主細胞才能完成自身的一系列生物反應。而在田間實際操作的過程中,由于受人本身及工作量大小的影響,試驗者在接種時往往會用力過猛,對葉片造成大面積機械損傷,葉片細胞大量壞死,使病毒無法正常侵染葉片細胞。

(2)操作誤差偏大。在操作過程中,由于受田間工作量的影響,往往是由幾個人同時接種病毒。不同的操作者摩擦力度必然不同,即使同一人操作,也難保證對每一植株接種力度均勻,因此引入的操作誤差也不同、且誤差較大。在轉(zhuǎn)基因玉米的抗病性研究中,轉(zhuǎn)基因玉米株系多,但每個株系的株數(shù)少,即使單株引入的操作誤差都會極大地影響最終的分析結(jié)果。

(3)操作工作量較大。由于此方法必須在玉米苗種植或移栽至大田中方可進行,為了盡量減少抽樣誤差對結(jié)果分析的影響,必須由幾個人同時在盡量短的時間內(nèi)完成接種工作,比較耗費人力與物力。

本研究中應用人工苗床,結(jié)合玻璃纖維刷穿刺法接種玉米矮花葉病毒,通過顯微鏡下觀察并與田間接種的試驗數(shù)據(jù)比較,發(fā)現(xiàn)有如下優(yōu)點：

(1)對葉片的損傷程度小。通常,玻璃纖維單絲的直徑為幾微米到二十幾微米,相當于一根頭發(fā)絲的1/20～1/5,一般肉眼可見的每束纖維原絲都由數(shù)百甚至上千根單絲組成。因此,在操作過程中能模擬蚜蟲口針刺吸式傳毒,達到對葉片最小程度的損傷,有利于傷口周圍宿主細胞的存活,使病毒侵染的成功率大大提高,降低引入的操作誤差。由于玻璃纖維絲具有較好的柔韌性,在操作過程中,手的力度不直接作用于葉片,而是通過玻璃纖維絲作用于葉片上,玻璃纖維絲的良好彎折度對手的力量起到了緩沖作用,且大量的玻璃纖維絲分散了手的力度,使得每根單絲最終作用于葉片上的力度均勻性好,這不僅減小了葉片的損傷程度,更重要的是對葉片造成的傷口也更為均勻一致,操作誤差大大降低。

(2)降低了田間工作量。玻璃纖維穿刺接種法可在玉米苗移栽之前進行接種,此時還在苗床或育苗盤中的玉米苗相對集中,因此操作效率大大提高。通過本研究田間操作的效率對比,相同規(guī)模的試驗,石英砂摩擦接種法需要4人,而用玻璃纖維穿刺接種法僅需1人。

3.2 RNAi介導轉(zhuǎn)基因玉米的抗病性

本研究通過對RNAi片段介導的抗矮花葉病轉(zhuǎn)基因玉米材料的抗性鑒定,獲得了一批抗病性相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ兆越幌涤胁煌潭忍岣叩霓D(zhuǎn)基因玉米,但其中僅有2個株系表現(xiàn)為“抗病”,比抗病對照自交系‘H9-21’提高一個等級;63個株系中有13個表現(xiàn)“中抗”,抗病性與‘H9-21’相當或不及‘H9-21’;其余大部分轉(zhuǎn)基因株系抗病性雖比未轉(zhuǎn)化對照有小幅度提高,但仍鑒定為“感病”。因此,用轉(zhuǎn)基因方法獲得抗病材料,還需結(jié)合嚴格的田間抗病性篩選。在上述抗病性鑒定中,表現(xiàn)中抗的轉(zhuǎn)基因材料株高基本正常,均能授粉結(jié)實,而感病材料特別是高感材料株高顯著降低,葉片叢生,不能正常吐絲,因而難以結(jié)實。

從理論上講,RNAi片段一旦整合到玉米基因組,應該對病毒靶基因造成降解使其不能復制,從而達到完全抗病的目的,但試驗結(jié)果卻遠非如此簡單,其原因還需進一步探討。但試驗結(jié)果表明,干涉片段越長,獲得抗病材料的幾率越高。

3.3 抗矮花葉病轉(zhuǎn)基因受體的選擇

玉米矮花葉病重發(fā)區(qū)主要在黃淮海主產(chǎn)區(qū)。近年來,在四川、云南也常有發(fā)生(作者在繁育田塊經(jīng)常見到矮花葉病株),盡管暫時沒有造成嚴重損失,但其發(fā)展趨勢應引起育種者關(guān)注。用轉(zhuǎn)基因方法獲得抗病材料可以加快抗病育種進程,而轉(zhuǎn)基因研究常將愈傷組織作為受體。因此,能否高效誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織的自交系就成為轉(zhuǎn)基因受體選擇的重要依據(jù)。‘18-599紅’和‘18-599白’是西南玉米產(chǎn)區(qū)優(yōu)良自交系,易感矮花葉病,且能誘導產(chǎn)生高質(zhì)量的胚性愈傷組織,是外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)良受體。生產(chǎn)上一些易感品種,由于不能產(chǎn)生胚性愈傷組織而難以直接應用于轉(zhuǎn)基因受體,但可通過回交轉(zhuǎn)育改良其抗病性。

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(責任編輯：楊明麗)

Resistance evaluation of RNA interference-based transgenic maize to Maize dwarf mosaic virus by two artificial inoculation methods

Li Yanping, Li Lei, Zhang Zhiyong, Shen Xiaojuan, Li Wanchen, Fu Fengling

(Maize Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

Resistance of the 63 transformed lines was evaluated by disease index of maize at adult stage in field experiment by two artificial inoculation methods.The results showed that the resistant grade of the T4transformed lines‘47’and‘13h2-3’was R grade,higher than that of the resistant control‘H9-21’,and 82.5%(52/63)of the transformed lines had significantly higher resistance than non-transformed control lines.It is concluded that the transformation by reverse repeated RNA-interference expression vector is an effective method to obtain transformed materials for virus resistance.The resistance will be improved if the interference fragment has an appropriate length.In addition,it was found that puncturing inoculation by glass fiber brush in seedbed was of less deviation than conventional inoculation by quartz sand friction.

maize; RNA interference; transgene; Maize dwarf mosaic virus; resistance

S 432.21

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.028

2014-09-11

2014-11-03

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2009ZX08003-012B)

*通信作者 E-mail：aumdyms@sicau.edu.cn