小菜蛾ABCG2 mRNA表達(dá)特征及茚蟲威對(duì)其表達(dá)量的影響

朱 航, 王雅菲, 周小毛,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所,長(zhǎng)沙 410128;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,長(zhǎng)沙 410125)

小菜蛾ABCG2 mRNA表達(dá)特征及茚蟲威對(duì)其表達(dá)量的影響

朱 航1, 王雅菲1, 周小毛1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所,長(zhǎng)沙 410128;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,長(zhǎng)沙 410125)

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù),測(cè)定了小菜蛾不同發(fā)育階段、4齡幼蟲不同組織ABCG2 m RNA相對(duì)表達(dá)量的差異,并進(jìn)一步檢測(cè)了茚蟲威的LC50劑量對(duì)小菜蛾3齡幼蟲ABCG2 m RNA表達(dá)量的影響。結(jié)果表明,不同發(fā)育階段小菜蛾ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在雄性成蟲中最高,明顯高于其他幾個(gè)發(fā)育階段,分別是3齡的5.63倍、4齡的3.67倍、蛹期的7.36倍、雌蟲的3.51倍。4齡幼蟲的ABCG2 mRNA在中腸中的表達(dá)量最高,分別是馬氏管、精巢、殘余體的3.12倍、8.96倍、7.33倍,在頭和表皮的表達(dá)量最低;使用茚蟲威的LC50濃度處理小菜蛾3齡幼蟲后,ABCG2 mRNA的表達(dá)量逐步上升。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究茚蟲威在小菜蛾體內(nèi)的代謝與ABCG2之間的關(guān)系提供一定的參考。

小菜蛾; 茚蟲威; ABCG2 mRNA; 熒光定量PCR

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]屬鱗翅目(Lepidoptera),菜蛾科(Plutellidae),一年發(fā)生多代,其繁殖率高,世代重疊現(xiàn)象嚴(yán)重,是鱗翅目昆蟲中分布最廣泛的害蟲[1]。盡管人們做了大量工作制定和完善小菜蛾的綜合防治策略[23],但由于小菜蛾本身繁殖很快,加上全球范圍內(nèi)大量使用農(nóng)藥,加快了對(duì)其抗藥性的選擇[4],導(dǎo)致小菜蛾對(duì)多種類型的農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性并且抗藥性越來(lái)越強(qiáng),成為嚴(yán)重危害十字花科蔬菜作物的一種世界性害蟲。茚蟲威(indoxacarb)是由美國(guó)杜邦公司開發(fā)的二嗪類殺蟲劑,由于其作用機(jī)制獨(dú)特,對(duì)鱗翅目害蟲具有卓越的殺蟲活性,且對(duì)非靶標(biāo)生物安全,成為替代有機(jī)磷類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑防治鱗翅目害蟲的理想品種[5-7]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全稱為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters),是一大類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,共分7個(gè)亞家族(ABCA～ABCG),它們能夠利用水解ATP產(chǎn)生的能量介導(dǎo)多種生物分子在細(xì)胞內(nèi)外的運(yùn)輸[8],降低細(xì)胞內(nèi)生物分子的濃度,目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究比較多。多項(xiàng)報(bào)道稱ABC基因家族的B、C、G亞族有介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[9-12],例如,P-糖蛋白(基因符號(hào)ABCB 1)、MRP1(基因符號(hào)ABCC1)、MRP2(基因符號(hào)ABCC2)和BCRP(基因符號(hào)ABCG2)跟藥物抗藥性有關(guān),它們能夠?qū)⒂卸镜耐庠次锎x并運(yùn)送到細(xì)胞外[13]。鑒于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重要性,研究者對(duì)一些昆蟲,如果蠅、家蠶、粉紋夜蛾等體內(nèi)的部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了研究。Labbé等從粉紋夜蛾和家蠶中分別獲得B、C、G亞族的8、6、13條基因,分析了鱗翅目昆蟲對(duì)殺蟲劑等外源化合物的抗性,指出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能起到顯著的作用[14]。近年來(lái),有報(bào)道稱ABCC2與ABCB1分別與小菜蛾對(duì)Bt和阿維菌素的抗性相關(guān)[15-16]。目前,已報(bào)道的昆蟲ABCG2還很有限。ABCG2是一種半轉(zhuǎn)運(yùn)體,包括一個(gè)跨膜區(qū)域(transmembrane domain,TMD)和一個(gè)核酸結(jié)合區(qū)域(nucleotide-binding domain,NBD),是全轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1、ABCC1、ABCC2結(jié)構(gòu)域的一半,盡管與ABCB1、ABCC1和ABCC2在結(jié)構(gòu)域上存在差異,但是在對(duì)藥物的抗性中是同時(shí)發(fā)生作用的[14]。本試驗(yàn)比較了小菜蛾不同發(fā)育階段ABCG2 m RNA相對(duì)表達(dá)量的差異,分析了4齡幼蟲不同組織中的ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異,以及茚蟲威處理對(duì)ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響,以期為以后研究茚蟲威在小菜蛾體內(nèi)代謝與ABCG2的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試?yán)ハx

小菜蛾敏感種群由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供,在溫度為(28±1)℃,相對(duì)濕度60%～70%,光周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱中用人工飼料喂養(yǎng)11代。成蟲則以15%的蜂蜜水進(jìn)行飼喂。

1.1.2 主要試劑和儀器

ABI 7300 Real Time PCR儀(美國(guó)ABI公司); GZ-800-GSI人工氣候箱,韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;茚蟲威原藥(indoxacarb,95%)上海悅聯(lián)化工有限公司提供;RNA提取試劑TRIzol由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn);TransScriptTMAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for PCR(AT 321),購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同發(fā)育期小菜蛾材料的準(zhǔn)備

選取小菜蛾1～4齡幼蟲以及蛹、雌性成蟲、雄性成蟲各3頭,用液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用,每個(gè)發(fā)育期4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 小菜蛾4齡幼蟲不同組織部位材料的準(zhǔn)備

在PBS緩沖液中解剖20頭健康的4齡小菜蛾幼蟲,獲得小菜蛾的頭、表皮、中腸、馬氏管、精巢和其他殘余物,將各組織在PBS緩沖液中清洗3次,然后用液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用,每5頭幼蟲一組,每種組織包括4個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣本。

1.2.3 茚蟲威處理小菜蛾

為了檢測(cè)在茚蟲威刺激下,小菜蛾ABCG2在轉(zhuǎn)錄水平上的反應(yīng),將直徑為6 cm的甘藍(lán)葉片在0.43 mg/L茚蟲威(該濃度為對(duì)敏感種群3日齡3齡幼蟲的LC50)溶液中浸漬10 s,對(duì)照為不經(jīng)藥物處理的葉片,晾干后放置在底部鋪有潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中,接入饑餓2 h的小菜蛾3齡幼蟲,每皿20頭活蟲,放入人工氣候培養(yǎng)箱中,在溫度(28± 1)℃,相對(duì)濕度60%～70%,光周期L∥D=16 h∥8 h下,分別喂養(yǎng)24、48、72 h,每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù),挑出存活的幼蟲用液氮迅速冷卻,放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小菜蛾總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

按照TRIzol(Invitrogen)試劑說(shuō)明中的步驟分別提取不同齡期以及經(jīng)茚蟲威處理的小菜蛾總RNA和不同組織的RNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,利用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的純度,合格后使用TransScriptTMAll-in-One First-Strand c DNA Synthesis Super Mix for PCR將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,產(chǎn)物于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物的設(shè)計(jì)與合成以及內(nèi)參基因的選擇

根據(jù)小菜蛾基因組中的ABCG2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物G2YG-F和G2YG-R(表1),引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。將反轉(zhuǎn)錄獲得的小菜蛾cDNA按10倍梯度稀釋(1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000)后作為模板,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測(cè),引物的擴(kuò)增效率為96%符合定量試驗(yàn)要求。近幾年研究表明,在實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)中,不同處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因的表達(dá)存在一定的差異,所以,針對(duì)處理?xiàng)l件的不同,應(yīng)選用相應(yīng)條件下表達(dá)更穩(wěn)定的內(nèi)參基因[17]。因此本文在研究不同發(fā)育期、不同組織以及在茚蟲威LC50濃度處理?xiàng)l件下ABCG2 mRNA表達(dá)量試驗(yàn)中,選用內(nèi)參基因?yàn)檠由煲蜃?elongation factor 1, EF1)、核糖體蛋白L32(ribosomal protein L32, RPL32)和核糖體蛋白S23(ribosomal protein S23, RPS23),詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣,然后將樣品置于ABI 7300 Real Time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序設(shè)置：95℃15 min;95℃10 s,55℃20 s,72℃31 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析,其中ΔΔCt= (Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照,通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,LSD法進(jìn)行多重比對(duì),圖表用Sigmaplot 12.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABCG2 mRNA在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

根據(jù)圖1所示可以看出,小菜蛾ABCG2 mRNA在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量存在一定的差異。其中在雄性成蟲中表達(dá)量最高,分別是3齡幼蟲的5.63倍、4齡的3.67倍、蛹期7.36倍、雌蟲的3.51倍。幼蟲期ABCG2 mRNA的表達(dá)量隨齡期增加無(wú)顯著差異。

圖1 ABCG2 mRNA在小菜蛾不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression quantities of ABCG2 mRNA at different developmental stages of Plutella xylostella

2.2 ABCG2 mRNA在4齡幼蟲不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

從圖2可看出,小菜蛾4齡幼蟲ABCG2 mRNA在中腸、馬氏管、精巢、殘余體相對(duì)表達(dá)量各不相同。其中在中腸中的相對(duì)表達(dá)量最高,分別是馬氏管、精巢、殘余體的3.12、8.96、7.33倍,ABCG2 mRNA在頭和表皮的表達(dá)量很低。

圖2 ABCG2 mRNA在不同組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression quantities of ABCG2 mRNA in different tissues

2.3 茚蟲威處理對(duì)ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖3所示,在茚蟲威的刺激下,小菜蛾3齡幼蟲ABCG2 mRNA在轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出相應(yīng)的反應(yīng),表現(xiàn)為隨處理時(shí)間增加表達(dá)量上升,而且在處理1、2、3 d時(shí),表達(dá)量分別為同齡期無(wú)任何藥劑處理組(處理方法同1.2.3)的2.16、4.32、6.76倍。

圖3 茚蟲威處理后ABCG2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of ABCG2 mRNA after treatment with indoxacarb

3 討論

越來(lái)越多的研究者意識(shí)到在實(shí)時(shí)熒光定量分析中使用1個(gè)內(nèi)參基因容易產(chǎn)生系統(tǒng)誤差,所以為了減少計(jì)算結(jié)果的系統(tǒng)誤差,應(yīng)選用2～3個(gè)內(nèi)參基因,因此本試驗(yàn)選用了在生物因子和非生物因子條件下都表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性的3個(gè)內(nèi)參基因EF1、 RPL32和RPS23。ABCG2在小菜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)模式與煙芽夜蛾體內(nèi)ABC蛋白基因相似[18],有報(bào)道稱鱗翅目家蠶體內(nèi)幾種起代謝解毒作用的基因存在性別上的差異,這些基因在雌雄個(gè)體間表達(dá)量的差異導(dǎo)致代謝解毒能力在性別間存在差異[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABCG2 m RNA在小菜蛾雌雄個(gè)體間的表達(dá)量也存在差異,由于目前ABC類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鱗翅目昆蟲中研究較少,所以該基因在雌雄個(gè)體間差異表達(dá)的原因有待進(jìn)一步研究。小菜蛾ABCG2 mRNA在4齡幼蟲的不同組織均有表達(dá),其中在中腸的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是馬氏管,這與在家蠶中的研究結(jié)果一致[20]。而且,粉紋夜蛾幼蟲的中腸、馬氏管中與ABCG2基因功能相近的ABCB 1基因的表達(dá)量很高[21]。這可能是由于中腸是昆蟲十分重要的消化和吸收器官,馬氏管是重要的排泄器官,這兩個(gè)器官都跟外源物質(zhì)的吸收和代謝有關(guān),所以這兩個(gè)部位ABCG2的高表達(dá)表明ABCG2可能在外源物質(zhì)茚蟲威的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收、代謝中起到一定的作用。生物體通過(guò)復(fù)雜的解毒系統(tǒng)來(lái)保護(hù)機(jī)體免受外源有毒物質(zhì)的侵害。在代謝抗性中,有多種酶參與將有毒物質(zhì)降解為低毒產(chǎn)物并促進(jìn)產(chǎn)物排出機(jī)體外[22]。ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以自主結(jié)合有毒物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。Tapadia等研究發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅經(jīng)過(guò)秋水仙素處理后,P-糖蛋白(ABCB 1)基因被誘導(dǎo)呈現(xiàn)高表達(dá)[21]。有報(bào)道稱黑腹果蠅在高劑量的MRP的底物甲氨蝶呤毒素作用下, MRP1(基因符號(hào)ABCC1)直系同源物d MRP1被誘導(dǎo)高表達(dá)[23]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在茚蟲威的刺激下,小菜蛾的ABCG2在轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)為表達(dá)量上升,而且,隨著處理時(shí)間的增加,表達(dá)量不斷升高,表明ABCG2對(duì)茚蟲威刺激存在應(yīng)激反應(yīng)。這可能是因?yàn)樾〔硕甑腁BCG2參與了茚蟲威在小菜蛾體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),被茚蟲威誘導(dǎo)所致,使其解毒代謝功能發(fā)揮了相應(yīng)的作用。

本研究結(jié)果可為研究茚蟲威在小菜蛾體內(nèi)的代謝與ABCG2之間的關(guān)系提供參考,下一步可通過(guò)RNAi技術(shù)開展基因功能驗(yàn)證的工作,進(jìn)一步研究ABCG2與昆蟲抗藥性之間的關(guān)系。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Characteristics of mRNA relative expression of ABCG 2 in Plutella xylostella and the effect of indoxacarb on its expression

Zhu Hang1, Wang Yafei1, Zhou Xiaomao1,2

(1.Institute of Pesticide Science,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410125,China)

q RT-PCR was used to determine the expression of ABCG 2 m RNA at different developmental stages of Plutella xylostella(L.)and in different tissues of its 4th-instar larvae.And influence of LC50of indoxacarb on expression of ABCG 2 m RNA in the 3rd-instar larvae was also investigated.The results showed that the expression of ABCG 2 m RNA in male adults of P.xylostella was significantly higher than those in other stages,which was 5. 63,3.67,7.36 and 3.51 times of that in the 3rd-,4th-instar larvae,the pupal stage,and the female adults,respectively.In different tissues of the 4th-instar larvae,the mid-gut had the highest expression,which was 3.12, 8.96 and 7.33 times of that in the Malpighian tubule,testis and carcass,respectively.The expression of ABCG 2 m RNA in the head and integument were the lowest.To further identify the effect of indoxacarb on ABCG 2 m RNA,the relative expression of ABCG 2 mRNA in 3rd-instar larvae treated by indoxacarb was also analyzed.The results suggested that the expression of ABCG 2 increased gradually over time.The results are helpful for further study of the relationship of ABCG2 expression and indoxacarb resistance in P.xylostella.

Plutella xylostella; indoxacarb; ABCG 2 mRNA; q RT-PCR

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.021

2014-11-05

2015-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371966)

*通信作者 E-mail：zhouxm1972@126.com