綠豆葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

劉昌燕, 肖炎農(nóng), 吳小微, 李 莉, 陳宏偉, 劉良軍, 萬正煌*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室,武漢 430064;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430064)

綠豆葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

劉昌燕1, 肖炎農(nóng)2, 吳小微2, 李 莉1, 陳宏偉1, 劉良軍1, 萬正煌1*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室,武漢 430064;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430064)

對綠豆葉斑病菌進行形態(tài)學(xué)和分子特征鑒定,結(jié)果表明,分離物在V8培養(yǎng)基上菌落近圓形,菌落邊緣泛紫色,分生孢子無色;用通用引物18SF和28SR擴增6個分離物的rDNA-ITS部分序列和測序,并到GenBank(登錄號：KM435076)數(shù)據(jù)庫進行比對,6個分離物與變灰尾孢分離物序列相似性為99%,基于形態(tài)和分子特征將綠豆葉斑病病原菌鑒定為變灰尾孢。致病性測定結(jié)果表明,6個分離物對綠豆‘中綠一號’葉片均致病且存在致病力差異。不同培養(yǎng)基、溫度和p H對病原菌生長的影響研究表明,V8培養(yǎng)基最適宜該病菌生長,病菌生長的最適溫度為25℃,最適p H為6。

綠豆; 葉斑病; 變灰尾孢; 鑒定; 生物學(xué)特性

綠豆葉斑病是綠豆生產(chǎn)上主要的真菌病害,廣泛分布于我國各大綠豆產(chǎn)區(qū)。安徽、河南、陜西、河北等省是綠豆葉斑病的常發(fā)區(qū),給當(dāng)?shù)氐木G豆生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。該病由尾孢菌屬的多個種引起,其中變灰尾孢(Cercospora canescens)被認(rèn)為是最主要的病原菌。病原菌主要侵染綠豆植株的葉部,嚴(yán)重時導(dǎo)致穿孔,葉片枯死[13]。一般造成20%～50%的綠豆產(chǎn)量損失,最高可達90%以上[46]。

綠豆葉斑病雖然造成損失嚴(yán)重,但我國尚缺乏對該病害的深入系統(tǒng)研究,該病害的發(fā)生發(fā)展沒有引起足夠的重視,相關(guān)參考資料很少。本研究結(jié)合傳統(tǒng)的植物病原鑒定方法和分子生物學(xué)技術(shù)對該病害的病原菌進行了鑒定,并對其生物學(xué)特性進行了初步研究,以期為綠豆葉斑病的流行、防治、抗性資源篩選和抗病品種選育提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

從病田采集具典型癥狀的病葉,用常規(guī)組織分離方法進行病原菌分離[7]。將從田間采集的發(fā)病葉片輕輕沖洗干凈,從病健交界處切取3 mm×3 mm小塊組織;用75%乙醇溶液浸泡2～3 s,再用1%次氯酸鈉消毒3 min,后用滅菌水沖洗3次,用無菌吸水紙吸干,然后接種到V8培養(yǎng)基上,在28℃條件下培養(yǎng);病原菌長出后轉(zhuǎn)入V8培養(yǎng)基進一步純化,選6個分離物用于進一步研究,編號為Cc-1～Cc-6。

1.2 病原菌形態(tài)觀察

將分離物接種在V8培養(yǎng)基28℃培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)。從綠豆葉片病斑表面刮取病菌的分生孢子和分生孢子梗,在光學(xué)顯微鏡下觀察,并在顯微照相系統(tǒng)100倍油鏡下照相。

1.3 致病性鑒定

采用離體葉片菌絲塊接種法測定病原菌的致病性[8]。6個分離物在V8培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)15 d,接種前用直徑6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅作為接種體。挑選顆粒飽滿,大小接近的‘中綠1號’綠豆種子,進行表面消毒,用75%乙醇消毒20 s,1%NaClO消毒3 min,最后用無菌水洗3次;表面消毒后的種子放在2～3層噴有水的吸水紙上,室溫條件下放置12～24 h,待綠豆種子的胚芽突破種皮,胚根伸長約0.5 cm時播種。將培養(yǎng)土高溫高壓滅菌后,分裝到培養(yǎng)盤內(nèi),整平,壓實苗床,控制土壤相對含水量約70%～80%,表面消毒后的種子點播到培養(yǎng)盤內(nèi),用細土層覆蓋種芽;12 h光照黑暗交替下培養(yǎng),定期觀察綠豆苗生長情況,適時澆水。取健康、位置相近的綠豆復(fù)葉葉片,用自來水沖洗葉片表面后放在塑料盒內(nèi)濕潤的吸水紙上,葉片的正面向上,中部稍偏葉脈部位用牙簽造成小傷口,取菌餅將菌絲面朝下接種到綠豆葉片傷口之上;接種后,塑料盒用保鮮膜封緊保濕,放入溫室25℃條件下培養(yǎng),每天12 h光照,每個分離物做4組重復(fù),每組重復(fù)接種3片葉,以接種V8培養(yǎng)基為對照。每日觀察病斑擴展情況,10 d后測量病斑直徑,每個病斑測量3次。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 DNA提取

分離物在V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周,收集菌絲,參照易克賢等的方法[9]進行基因組DNA的提取。

1.4.2 ITS區(qū)域擴增與測序

采用真菌核糖體r DNA區(qū)通用引物18SF(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3')和28SR(5'-TATCCCTACCTGATCCGAG-3')擴增ITS1和ITS2及5.8S DNA全序列[10]。PCR反應(yīng)體系包括：10× PCR緩沖液2.5μL、d NTPs各0.2 mmol/L、引物10 pmol/L、DNA模板10 ng、Taq DNA聚合酶1.0 U。同時以加無菌水為模板,其他條件不變作為對照。

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s、56℃45 s、72℃1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在恒壓150 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收6個分離物目標(biāo)片段,純化后由武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序。將測序獲得的分離物ITS序列直接在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析并提交序列。

1.5 培養(yǎng)基對分離物生長速率的影響

選用PDA、PSA、V8、Czapek和Richard共5種培養(yǎng)基,用打孔器打出6 mm的菌餅,分別接種在直徑為9 cm的平板中央,在28℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)15 d,用十字交叉法測量菌落直徑,計算菌落生長速率(mm/d),每處理5個重復(fù)[7]。生長速率=(第15天菌落直徑-第7天菌落直徑)/8。

1.6 溫度對分離物生長速率的影響

將6 mm的菌塊接種到PDA平板的中央,分別置于15、20、25、30、35、40℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每處理5個重復(fù)。培養(yǎng)條件和測量方法同1.5。

1.7 p H對分離物生長速率的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的p H分別調(diào)節(jié)成2～11,在平板中央接種6 mm的菌塊,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每處理5重復(fù)。培養(yǎng)條件和測量方法同1.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

綠豆葉斑病菌主要危害葉片,花蕾期開始發(fā)病,最初葉片上出現(xiàn)2～15 mm水漬狀褐色小點,擴展后形成邊緣紅褐色至紅棕色、中間淺灰色至淺褐色近圓形病斑(圖1)。濕度大時,病斑上密生灰色霉層。在綠豆開花結(jié)莢期,病斑急劇擴展融合成片,很快干枯,接著葉片枯死穿孔脫落、早衰,全株死亡。

2.2 病原菌形態(tài)鑒定

所有菌株在V8培養(yǎng)基上菌落近圓形,邊緣光滑,氣生菌絲致密,菌落邊緣泛紫色。分生孢子針形或倒棍棒形,無色,直立或稍彎曲,有3至多個隔膜,領(lǐng)部尖細至近鈍,基部倒圓錐形平截至平截。(圖2)。這一觀察結(jié)果與郭英蘭等[11]描述的寄生在豆科植物上的尾孢菌基本一致,故確認(rèn)綠豆葉斑病的病原菌為尾孢菌(Cercospora sp.)。

圖2 綠豆葉斑病菌菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.2 Colonies of leaf spot cultured in V8 and conidia under microscope

2.3 致病性測定

將6個分離物分別接種在‘中綠一號’復(fù)葉葉片上,均導(dǎo)致綠豆葉片發(fā)病。選擇部分發(fā)病植株再進行病原菌的分離,目標(biāo)分離物獲得率為100%。10 d后測定病斑大小,分離物Cc-5接種后產(chǎn)生的病斑面積最大,致病性最強;Cc-3次之,致病力稍弱;Cc-2、Cc-4、Cc-6居中;Cc-1接種后病斑面積最小,致病力最弱(圖3)。

圖3 不同分離物對‘中綠一號’綠豆致病力差異Fig.3 Differences in the pathogenicity of different isolates to mung bean‘Zhonglv No.1’

2.4 ITS序列分析

用r DNA-ITS通用引物18SF/28SR對6個分離物基因組DNA進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4。引物18SF/28SR在6個分離物中均擴增出大小為500 bp左右的片段,雙蒸水即CK-則無擴增條帶。6個擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、測序,得到的片段大小為466 bp。將獲得的分離物序列(GenBank上登錄號為KM435076)在NCBI上進行BLAST分析,與C.canescens相似性達到99%。結(jié)合上述菌落和孢子形態(tài)鑒定、田間病害癥狀、對綠豆葉片致病性測定和ITS分子鑒定結(jié)果,將引起綠豆葉斑病的病原菌鑒定為變灰尾孢(C.canescens)。

2.5 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

以分離物Cc-5為代表進行生物學(xué)特性研究。供試分離物在5種供試培養(yǎng)基上的生長速率差異不顯著,但在V8培養(yǎng)基上生長速率相對較快,菌落直徑最大,培養(yǎng)7 d的菌落直徑為23.58 mm,最適合分離物的生長(圖5);分離物在Richard和Czapek培養(yǎng)基上菌落生長速度大于PDA和PSA培養(yǎng)基,但是菌落太稀疏;病原菌的顏色和形態(tài)在各培養(yǎng)基上存在較大差異。

圖4 ITS引物18SF/28SR對6個分離物的擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of six isolates with ITS primers 18SF/28SR

圖5 培養(yǎng)基對菌落生長速率的影響Fig.5 Effects of culture media on colony growth rate

2.6 溫度對菌絲生長的影響

溫度對病原菌菌落生長的影響如圖6所示。結(jié)果表明,分離物Cc-5在25℃生長最快,平均生長速率為3.42 mm/d,在溫度15℃和35℃條件下生長較為緩慢,平均生長速度為0.78 mm/d和0.36 mm/d, 40℃條件未見有菌落形成。

圖6 溫度對菌落生長速率的影響Fig.6 Effects of temperature on colony growth rate

2.7 p H對菌絲生長的影響

從圖7可以看出,分離物Cc-5在p H為2～11范圍內(nèi)均能生長,說明該病原菌有較好的p H耐受性;在p H為6時,生長速率最快,生長速率為3 mm/d,說明該病原菌弱酸性最適宜生長。

圖7 p H對菌落生長速率的影響Fig.7 Effects of p H on colony growth rate

3 討論

李怡琳等[12]1982-1986年對綠豆葉斑病進行了研究,通過對不同地區(qū)大量標(biāo)樣的鑒定,確認(rèn)變灰尾孢菌是引起綠豆葉斑病的病原菌。

綠豆葉斑病病原菌在培養(yǎng)基上生長十分緩慢,分離困難。本研究利用V8培養(yǎng)基能有效分離綠豆葉斑病病原菌,原因可能是V8培養(yǎng)基除了提供基本營養(yǎng)外,還可以提供多種維生素,促進了病原菌的生長。

ITS區(qū)域測序結(jié)果表明,6個分離物序列與Gen Bank中C.canescens序列相似性為99%。致病性測定表明,6個分離物可導(dǎo)致綠豆品種‘中綠一號’發(fā)病,且分離物間存在致病力的差異。因此,基于田間病害癥狀、病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征以及對綠豆的致病性,確定引起所鑒定的綠豆葉斑病病原菌為變灰尾孢(C.canescens)。這是國內(nèi)首次對引起綠豆葉斑病的病原菌進行系統(tǒng)鑒定。

綠豆葉斑病主要發(fā)生在綠豆開花前(4～5片復(fù)葉時),并在田間多次反復(fù)侵染,在開花結(jié)莢期常造成大量落葉,致使嚴(yán)重減產(chǎn)或失收。綠豆葉斑病菌以菌絲體和分生孢子隨病株在土壤內(nèi)越冬,翌年隨氣流擴散再侵染。生長季節(jié)危害葉片,開花前后擴展較快,借風(fēng)雨傳播蔓延。炎熱潮濕條件下,經(jīng)分生孢子多次再侵染,病原菌大量積累,遇有適宜條件即流行。高溫高濕有利于該病發(fā)生和流行,尤以秋季多雨、連作地或反季節(jié)栽培發(fā)病重;若少雨干旱,則發(fā)病較輕。馮耀景等[13]對綠豆葉斑病的發(fā)生調(diào)查表明,綠豆葉斑病的發(fā)病程度與空氣濕度和溫度有關(guān)。濕度為85%～90%、溫度為25～28℃時,病情發(fā)展最快,綠豆葉片受害最重,莖、花梗也會受害[13]。該病在開花前發(fā)生,初發(fā)時,葉片上出現(xiàn)褐色病斑,邊緣帶黃圈,后期多個病斑連成直徑5～10 mm的大病斑,遇炎熱潮濕條件病斑會擴大至整個葉片枯死,如花莢期高溫多濕氣候常形成病害大發(fā)生,抑制植株光合作用[13]。

本研究表明綠豆葉斑病病原菌的生長最適溫度為25℃,最適p H為6。這一結(jié)果與張益先等[15]和劉慶奎等[16]對玉米灰斑病菌的研究結(jié)果一致。變灰尾孢在人工培養(yǎng)條件下不容易產(chǎn)生分生孢子,本試驗中所獲菌株除了在V8培養(yǎng)基上產(chǎn)孢外,在PDA、PSA、Richard和Czapek培養(yǎng)基上均未能產(chǎn)孢。因此,還需要嘗試其他不同的培養(yǎng)基配方,期望能找到一種有利于變灰尾孢產(chǎn)孢的培養(yǎng)基,通過研究我國綠豆葉斑病病原菌的生物學(xué)特性,在防治綠豆葉斑病方面提供一定的理論基礎(chǔ)。目前,隨著全球氣候變暖,極端天氣越來越多,變灰尾孢具有較大的溫度范圍適應(yīng)特性,其引起的綠豆葉斑病可能具有加重的趨勢,應(yīng)該引起足夠的重視,并加強防治研究。

[1] Chand R,Singh V,Pal C,et al.First report of a new pathogenic variant of Cercospora canescens on mung bean(Vigna radiata)from India[J].New Disease Reports,2012,26：6.

[2] Thakur R P,Patel P N,Verma J P.Genetical relationships between reactions to bacterial leaf spot,yellow mosaic and Cercospora leaf spot diseases in mung bean(Vigna radiata)[J].Euphytica,1977,26：765-774.

[3] Iqbal S M,Zubair M,Haqqani A M.Resistance in mung bean to Cercospora leaf spot disease[J].International Journal of Agriculture and Biology,2004,6(5)：792-793.

[4] 王彥,田靜,范保杰,等.小豆主要病害研究進展[J].華北農(nóng)學(xué)報,2011,26(S1)：197-201.

[5] 邢寶龍,馮高,郭新文,等.綠豆尾孢菌葉斑病田間藥劑防治試驗[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(3)：264-266.

[6] 劉昌燕,仲建鋒,萬正煌,等.化學(xué)藥劑對綠豆尾孢菌葉斑病的田間防治效果比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(25)：10307-10312.

[7] 方中達.植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社,1998：46-50.

[8] Castro M,Kramer K,Valdivia L,et al.A double-stranded RNA mycovirus confers hypovirulence-associated traits to Botrytis cinerea[J].FEMS Microbiology Letters,2003,228(1)：87-91.

[9] 易克賢,黃俊生,劉國道,等.中國柱花草炭疽病原菌遺傳多態(tài)性的RAPD分析[J].微生物學(xué)報,2003,43(3)：379-387.

[10]楊臘英,黃華平,唐復(fù)潤,等.香蕉炭疽菌rDNA ITS區(qū)的分子鑒定與檢測[J].植物病理學(xué)報,2006,36(3)：219-225.

[11]郭英蘭,劉錫琎.中國真菌志-尾孢菌屬(24卷)[M].北京：科學(xué)出版社,2005：148-150.

[12]李怡琳,李淑英.綠豆品種抗葉斑病鑒定研究[J].作物品種資源,1987(4)：12-14.

[13]馮耀景,蘇永福,王輝.泌陽縣綠豆主要病蟲害發(fā)生特點及綜合防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(19)：197-201.

[14]侯慧穎,張玉訓(xùn),陳麗.綠豆病蟲害發(fā)生及防治措施[J].種業(yè)導(dǎo)刊,2009(9)：34.

[15]張益先,呂國忠,梁景頤,等.玉米灰斑病菌生物學(xué)特性研究[J].植物病理學(xué)報,2003,33(4)：292-295.

[16]劉慶奎,秦子慧,張小利,等.中國玉米灰斑病病原菌的鑒定及其基本特征研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(19)：4044-4057.

(責(zé)任編輯：田 喆)

Pathogen identification and biological characteristics of mung bean Cercospora leaf spot

Liu Changyan1, Xiao Yannong2, Wu Xiaowei2, Li Li1, Chen Hongwei1, Liu Liangjun1, Wan Zhenghuang1

(1.Institute of Food Crops,Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement,Wuhan 430064,China;2.College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430064,China)

The morphology and molecular characteristics of mung bean leaf spot were studied.The results indicated that the colony of isolates was circular in V8 medium,the edge was purple and the conidia were colorless.The partial r DNA-ITSsequences of six isolates were amplified with universal primers 18SF and 28SR.The obtained ITS sequences(GenBank accession No.KM435076)were aligned with Gen Bank and showed 99%similarity with isolates of Cercospora canescens.Based on morphological and molecular characteristics,the pathogen of mung bean leaf spot was identified as C.canescens.Pathogenicity test results showed that all mung bean cv‘Zhonglv No.1’leaves showed dark brown lesions when inoculated with six isolates and had virulence differences.The influences of different media,temperatures and p H values on the growth of pathogen were observed.V8 was the optimum culture medium for pathogen growth,at 25℃and p H 6.

mung bean; leaf spot disease; Cercospora canescens; identification; biological characters

S 436.43

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.014

2014-09-22

2014-12-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS09);科技部國際合作重點項目(2011DFB31620);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金項目(2014NKYJJ35)

*通信作者 E-mail：zhwan168@163.com