松花菜花球腐爛病病原分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

王國榮, 劉曉曦, 吳金丹, 王文鳳, 蘇珍珠, 樓兵干*

(1.浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,杭州 311203;2.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所,

杭州 310029;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,合肥 230036)

松花菜花球腐爛病病原分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

王國榮1, 劉曉曦2, 吳金丹2, 王文鳳3, 蘇珍珠2, 樓兵干2*

(1.浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,杭州 311203;2.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所,

杭州 310029;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,合肥 230036)

松花菜花球腐爛病是近年來發(fā)生在浙江省松花菜種植區(qū)的一種嚴(yán)重病害,主要危害松花菜花球、花梗,引起花球變褐腐爛,花梗發(fā)黑枯萎,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。通過對松花菜花球腐爛病典型癥狀樣本的采集,病原菌的分離、純化,致病性測定,形態(tài)觀察,16S rDNA序列分析,脂肪酸分析和Biolog鑒定,明確病原菌為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye。選擇8種殺菌劑采用K-B滅菌濾紙片法對病菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌測定,結(jié)果表明,72%農(nóng)用硫酸鏈霉素和PHMB對該病菌有較強(qiáng)的抑制作用,其次中生菌素和三氯異氰尿酸也有一定的抑制作用。

松花菜花球腐爛病; 殺菌劑; PHMB; 藥劑篩選

被譽(yù)為“有機(jī)花菜”的松花菜,其口感、形狀有別于傳統(tǒng)緊花型花菜。因其營養(yǎng)豐富、口感好,適宜速凍及脫水加工等優(yōu)點(diǎn),受到種植者與消費(fèi)者的認(rèn)可[12]。近年來松花菜種植發(fā)展迅猛,浙江省種植面積已超6 667 hm2。然而,在種植過程中出現(xiàn)一種引起花球腐爛的病害,這種病害在緊花型花菜中很少出現(xiàn)。該病害全年可見,春季最為明顯,嚴(yán)重田塊病株率可達(dá)30%～60%,已成為制約松花菜發(fā)展的最重要因素。對于該病害,生產(chǎn)上有人認(rèn)為是凍害引起,有人認(rèn)為是雨水過多引起,也有人認(rèn)為是真菌病害,或者是缺素引起。而據(jù)我們觀察與診斷,這可能是一種細(xì)菌病害。為了探明引起浙江省松花菜花球腐爛的原因,我們對松花菜花球腐爛病的病原進(jìn)行了分離鑒定,在室內(nèi)對防治藥劑進(jìn)行了篩選,以期對松花菜生產(chǎn)管理起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離

2012-2014年連續(xù)在浙江省杭州市蕭山區(qū)舒蘭農(nóng)場、農(nóng)一場、浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司蕭山基地進(jìn)行田間調(diào)查,采集已發(fā)病且具有典型癥狀的松花菜病株,裝入干凈牛皮紙袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室。取病健交界處組織,進(jìn)行表面消毒后,采用平板畫線分離法在NA培養(yǎng)基(蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蔗糖5 g,牛肉浸膏3 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 m L,p H 7.0～7.2)上分離純化[3],分離純化的菌株接入NA試管中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

健康松花菜幼苗由蕭山農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供,當(dāng)苗長至5片葉時(shí)轉(zhuǎn)移到含600 g基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖=4∶1∶1)的盆(250 mm×240 mm)中,置于溫室中,定時(shí)定量澆水和澆灌營養(yǎng)液;當(dāng)松花菜長出花球后,用于1.1節(jié)中分離菌株的致病性測定。將分離純化的5株菌株,在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后,用無菌水洗脫細(xì)菌菌苔制成濃度約為108cfu/mL菌懸液,采用噴霧法接種于健康的松花菜花球上,針刺接種法接種于花梗和葉片主葉脈上,傷口法(用滅菌的手術(shù)剪蘸取菌液后在健康葉片上剪口)接種于葉片上,每株菌接種5株松花菜,以無菌水為對照,接種后套塑料袋保濕。定期觀察接種組與對照組花球、花梗、葉片和葉片主葉脈上的癥狀變化,記錄結(jié)果,待發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

1.3 病原菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征觀察

供試病原菌在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài),同時(shí)挑取培養(yǎng)了16～20 h的菌體,參照Schaad等[4]的方法進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 病原菌16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

參照Liu等[5]的方法提取細(xì)菌基因組DNA,根據(jù)Edward等人[6]發(fā)表的細(xì)菌16S rDNA基因通用引物對分離的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物P1為：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';反向引物P2為：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3',由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：10× PCR緩沖液(含Mg2+)5μL,d NTPs(10 mmol/L) 1μL,引物P1和P2(10 mmol/L)各1μL,模板DNA 2μL,Taq酶(5 U/m L)0.5μL,加dd H2O至總體積50μL;反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s,55℃退火l min,72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)DNA片段,由上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果用BLAST軟件在Gen Bank上進(jìn)行同源性比較。

1.5 病原菌的脂肪酸(FAME)鑒定

FAME鑒定采用美國Agilent 6890型氣相色譜系統(tǒng)。參照MIDI公司說明書及Xie等[7]的方法進(jìn)行。供試菌株在TSBA培養(yǎng)基(30 g胰蛋白胨大豆肉湯,15 g瓊脂,1 000 m L蒸餾水)上,于28℃生長36 h后,用無菌接種環(huán)挑取一環(huán)培養(yǎng)菌放入有螺帽的試管中,提取脂肪酸。鑒定結(jié)果通過微生物鑒定系統(tǒng)軟件[美國MIDI公司開發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定細(xì)菌的MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(library generation software)]獲得。把分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌種的脂肪酸信息進(jìn)行比對。

1.6 病原菌的Biolog鑒定

采用Biolog公司生產(chǎn)的GN(革蘭氏陰性菌)測試板和GN數(shù)據(jù)庫,按照操作規(guī)程進(jìn)行鑒定。病原菌在Biolog通用培養(yǎng)基BUGM(Biolog universal growth medium,51.7 g BUA瓊脂培養(yǎng)基,950 m L蒸餾水)上25℃培養(yǎng)24 h后用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.7 室內(nèi)殺菌劑篩選

1.7.1 供試殺菌劑

供試殺菌劑共8種,分別是：42%三氯異氰尿酸可濕性粉劑(湖南省海洋生物工程有限公司); 20%噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司);20%噻唑鋅懸浮劑(浙江新農(nóng)化工股份有限公司);72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑(華北制藥股份有限公司);3%中生菌素可濕性粉劑(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司);46%氫氧化銅水分散粒劑(美國杜邦公司);50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑(河南銀田精細(xì)化工有限公司);聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(PHMB)可溶性粉劑(海寧中聯(lián)化學(xué)有限公司)。

1.7.2 試驗(yàn)方法

室內(nèi)有效殺菌劑篩選采用K-B濾紙片擴(kuò)散法[8],菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,用滅菌水配成濃度約為108cfu/m L的細(xì)菌懸浮液,采用無菌棉棒均勻涂布于NA平板表面,涂菌后室溫干燥3～5 min。

初篩時(shí),將8種藥劑配制成5 000 mg/L,用無菌鑷子夾直徑為6 mm的滅菌濾紙片浸泡于配制好的藥液中,浸泡片刻后立即將紙片平放于直徑為9 cm含菌NA平板表面,每皿貼3張紙片,以浸泡滅菌水的紙片為對照,重復(fù)3次,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9],培養(yǎng)36 h后觀察測量抑菌圈直徑。

將初篩試驗(yàn)中產(chǎn)生抑菌圈的藥劑,繼續(xù)配制成濃度為2 000、1 000、500、200、100 mg/L的藥液,用上述同樣的方法測定抑菌圈直徑。

1.7.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)不同藥劑的不同濃度處理下的抑菌圈直徑,采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

引起松花菜花球腐爛病的病菌主要危害花球、花梗,也能夠侵染葉片。該病害最典型的癥狀是在花球或花蕾上形成深褐色斑點(diǎn)然后腐爛?；ㄇ虬l(fā)病初期出現(xiàn)黃色、黃褐色水漬狀斑點(diǎn)(圖1a),隨后斑點(diǎn)擴(kuò)大并增加,由黃褐色轉(zhuǎn)呈深褐色或黑色并腐爛(圖1b),病斑從花蕾向花梗擴(kuò)展,形成“V”字形黑色病斑(圖1b),潮濕時(shí)病部組織用手觸摸有黏膩感。葉片發(fā)病從葉緣開始向葉內(nèi)和兩側(cè)呈“V”形擴(kuò)展,病健交界處不明顯,病斑邊緣常具黃色暈(圖1c),但田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)葉片較少表現(xiàn)出癥狀。

2.2 病原菌分離與致病性測定

從具有典型花球腐爛病癥狀的松花菜病健交界處取樣,制成臨時(shí)玻片,在光學(xué)顯微鏡下觀察,可見從病組織中噴出大量細(xì)菌。從病部共分離純化到12株細(xì)菌菌株,分別是XHC-1、XHC-2、XHC-3、SHC-1、SHC-2、SHC-3、SHC-4、SHC-5、SHC-6、SHC-7、SHC-8和SHC-9。

將上述12株菌株在NA平板上畫線培養(yǎng)36 h,然后分別接種到健康的松花菜花球、花梗、葉片和主葉脈上。結(jié)果表明,菌株之間的致病性有差異,花球、花梗、葉片和主葉脈上接種菌株XHC-1、XHC-2、SHC-4、SHC-7、SHC-8、SHC-9后不發(fā)病;而接種菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6后第3～7天出現(xiàn)典型癥狀(圖1d～g),且病斑癥狀與田間癥狀一致,從接種后發(fā)病部位分離的菌株與供試細(xì)菌菌株的菌落特征相同,而接種無菌水的對照未見任何癥狀。選取菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

在所取微元內(nèi)各個(gè)表面所受到的應(yīng)力可以認(rèn)為是均勻分布的，根據(jù)材料力學(xué)中廣義胡克定理可知，微元在三向應(yīng)力應(yīng)變關(guān)系如式（4）所示。

2.3 病原菌培養(yǎng)形狀與形態(tài)特征觀察

從病部分離純化的細(xì)菌菌株在NA培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)后48 h出現(xiàn)形態(tài)一致的單菌落,菌落直徑約為1～2 mm,黃色,圓形凸起,邊緣整齊,菌落較稠,乳脂狀不透明(圖1i),革蘭氏染色反應(yīng)陰性。

2.4 病原菌16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

以菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6的總基因組DNA為模板,用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均擴(kuò)增出約1.5 kb的PCR產(chǎn)物(圖2),產(chǎn)物純化回收后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。結(jié)果表明,5株菌的測序結(jié)果一致。將SHC-1的測序結(jié)果提交至NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(登錄號為KP182149),用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較,通過與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析,結(jié)果表明分離菌株與野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris) (登錄號為KF057196.1)相似度最高,為99%。

2.5 病原菌的脂肪酸(FAME)鑒定

FAME鑒定結(jié)果匹配程度遵循Buyer等[12]的原則：相似性系數(shù)＜0.2,結(jié)果不可用;相似性系數(shù)≥0.5,鑒定到種。供試病原細(xì)菌菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6的FAME鑒定結(jié)果與16S r DNA的鑒定結(jié)果一致,與X.campestris pv. campestris最相似,相似度分別為0.75、0.76、0.73、0.68、0.72。

供試菌株XHC-3、SHC-1、SHC-3、SHC-5、SHC-6在BUGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,經(jīng)Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定,結(jié)果表明,5株菌與X. campestris pv.campestris相似系數(shù)均大于0.5,分別是0.73、0.70、0.69、0.75、0.71。

2.7 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果

K-B滅菌濾紙片法試驗(yàn)結(jié)果表明：供試的8種殺菌劑對松花菜花球腐爛病菌的抑菌作用不同。72%農(nóng)用硫酸鏈霉素WP、PHMB和三氯異氰尿酸對病菌有較好的抑制作用,其中PHMB在濃度為100 mg/L時(shí)仍有明顯的抑菌圈產(chǎn)生,中生菌素對病菌的生長有一定的抑制作用,而氯溴異氰尿酸僅在高濃度下對病菌有一定的抑制作用,氫氧化銅從高濃度到低濃度都可見抑菌圈,但都很小;噻唑鋅和噻菌銅在高濃度下對病菌也無抑制作用(表1)。

圖1 松花菜花球腐爛病癥狀、致病性試驗(yàn)結(jié)果和病原菌單菌落形態(tài)Fig.1 Symptoms of broccoli flower-ball rot disease,results of pathogenicity and single colonies on NA medium

圖2 引物P1、P2對分離菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of pathogenic bacterial strains using primers P1/P2

3 結(jié)論與討論

(1)從浙江省杭州市蕭山區(qū)采集的典型松花菜花球腐爛樣本中分離的菌株,經(jīng)致病性測定、病原形態(tài)觀察、16S rDNA序列分析、脂肪酸鑒定和Biolog鑒定,明確為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種[Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye]。此菌也稱甘藍(lán)黑腐病菌。大量文獻(xiàn)記載：甘藍(lán)黑腐病菌引起十字花科蔬菜黑腐病,在我國主要危害甘藍(lán)、結(jié)球白菜、不結(jié)球白菜、薹菜、芥菜、花椰菜、球莖甘藍(lán)、芥藍(lán)、青花菜、抱子甘藍(lán)、蕪青甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、蘿卜、薺菜等10余種十字花科蔬菜[10],該病菌主要危害十字花科蔬菜的葉片、葉柄和葉脈,對松花菜花球的危害卻鮮有報(bào)道。在浙江省調(diào)查的松花菜上,該病原菌主要危害花球,田間葉片很少見到癥狀,因此,我們把引起浙江省松花菜花球腐爛的病害稱為“松花菜花球腐爛病”。

(2)本次試驗(yàn)測定了8種殺菌劑對病原菌株的抑菌效果,結(jié)果表明PHMB、農(nóng)用硫酸鏈霉素和三氯異氰尿酸對病菌的抑制效果較好,中生菌素也有一定的抑制效果,而噻唑鋅、噻菌銅對該病菌無抑制作用。測定結(jié)果可為松花菜花球腐爛病的田間藥劑試驗(yàn)提供基礎(chǔ),但由于采用濾紙片法測定,結(jié)果受到藥劑溶解性和擴(kuò)散能力的影響,具一定局限性,同時(shí)也與藥劑產(chǎn)品批號等有關(guān)。

表1 8種殺菌劑對病原菌菌株SHC-1的抑菌效果1)Table 1 Inhibition effect of 8 fungicides on the pathogen SHC-1 at different concentrations

(3)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽是一種廣譜抗菌素,對細(xì)菌、真菌和酵母菌等均有殺滅作用,長期以來被廣泛用于醫(yī)藥行業(yè),以及化妝品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、紡織品、食品工業(yè)等[7]。本次試驗(yàn)表明PH MB對松花菜花球腐爛病病原菌具有較好的抑制作用,可為今后PH MB用于植物病害防治提供參考。

[1] 顧宏輝,趙振卿,盛小光,等.浙閩山地松花菜關(guān)鍵栽培技術(shù)[J].中國蔬菜,2011(21)：56-57.

[2] 顧宏輝,趙振卿,盛小光,等.浙江山地和平原地區(qū)松花菜栽培施肥關(guān)鍵技術(shù)[J].中國蔬菜,2011(20)：64-65.

[3] 方中達(dá).植病研究方法[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998：180-181.

[4] Schaad N W,Jones J B,Chun W.Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria[M].3rd Edition.USA：American Phytopathological Society,2001.

[5] Liu Lixia,Coenye T,Burns J L,et al.Ribosomal DNA-directed PCR for identification of Achromobacter(Alcaligenes)xylosoxidans recovered from sputum samples from cystic fibrosis patients[J].Journal of Clinical Microbiology,2002,40(4)：1210-1213.

[6] Edward U,Rogall T,Blocker H,et a1.Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes.Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA[J].Nucleic Acids Research,1989,17(19)：7843-7853.

[7] Xie Guanlin,Soad A,Swings J,et al.Diversity of gram negative bacteria antagonistic against major pathogens of rice from rice seed in the tropic environment[J].Journal of Zhejiang University(Science),2003,4(4)：463-468.

[8] 譚瑤,趙清,舒為群,等.K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(20)：2290-2291.

[9] 牛藝儒,寧官保.大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2005(12)：30-31.

[10]李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑腐病的發(fā)生與防治[J].當(dāng)代蔬菜,2004 (11)：36.

[11]李楊,李付剛.聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的合成及應(yīng)用[J].精細(xì)化工原料及中間體,2011(2)：27-29

[12]Buyer J S,Roberts D P,Russek C E.Soil and plant effects on microbial community structure[J].Canadian Journal of Microbiology,2002,48(11)：955-964.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Isolation,identification and fungicide screening of the pathogen of broccoli flower-ball rot disease in laboratory

Wang Guorong1, Liu Xiaoxi2, Wu Jindan2, Wang Wenfeng3, Su Zhenzhu2, Lou Binggan2

(1.Xiaoshan Agricultural Technology Extension Centre of Hangzhou City,Zhejiang 311203,China; 2.Institute of Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China;3.College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Broccoli flower-ball rot disease has become a serious disease in recent years in broccoli-producing areas of Zhejiang Province.It mainly infects the flower-ball and stalks of broccoli,causing the flower-ball brown and rot,and the stalks black and withered,and finally leads to a serious economic loss.In this study,we collected samples with typical symptoms of this disease,isolated and purified the pathogen,and then conducted a series of experiments,including the pathogenicity determination,observation on morphological characteristics,analysis of 16S r DNA gene sequences and fatty acid methyl esters(FAME),and Biolog identification.All of these results showed that the pathogen was Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dye.Moreover,we selected 8 kinds of fungicides to do the bacterial inhibition assay in the laboratory with K-B sterile filter paper.The results showed that 72%agricultural streptomycin sulfate and PHMB had strong inhibition action to the pathogen,and zhongshengmycin and trichloroiso cyanuric acid also had inhibition action to the pathogen to a certain extent.

broccoli flower-ball rot disease; fungicide; PHMB; fungicide screening

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.011

2014-12-09

2015-02-02

浙江省“三農(nóng)六方”資助項(xiàng)目(N20120623)

*通信作者 E-mail：bglou@zju.edu.cn