土壤pH對蕓薹根腫菌侵染及病害發(fā)生的影響

班潔靜, 侯明生, 蔡 麗

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院,武漢 430070)

土壤pH對蕓薹根腫菌侵染及病害發(fā)生的影響

班潔靜, 侯明生, 蔡 麗*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院,武漢 430070)

通過設(shè)置不同p H梯度,研究土壤p H對根腫菌侵染及病害發(fā)生的影響。結(jié)果表明：土壤酸性時病菌侵染速度快,堿性時慢,而強(qiáng)酸性和堿性土壤條件則抑制孢子萌發(fā);p H為6.0時最有利于根腫菌休眠孢子萌發(fā),萌發(fā)率最高,為53.96%;堿性條件可使初級原生質(zhì)團(tuán)變形凝結(jié)成球狀,不能正常分裂或延遲形成游動孢子囊,從而不利于根腫菌侵染。白菜發(fā)病率與病情指數(shù)隨p H升高,呈先上升后下降趨勢。其中,p H為5.0時,發(fā)病率和病情指數(shù)最高,p H 7.0～8.0時發(fā)病輕。因此,適宜的偏酸性環(huán)境條件下,通過作用于病菌休眠孢子萌發(fā)和侵染,提高病害危害程度,而中性或堿性條件干擾該過程并降低病害發(fā)生。

十字花科蔬菜根腫病; 蕓薹根腫菌; 土壤p H

十字花科作物根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)引起的一種世界性病害,一直是十字花科作物生產(chǎn)上的重要病害。該病害在世界不同國家和地區(qū)引起10%～15%的產(chǎn)量損失[1-2],重病區(qū)則高達(dá)70%[3]。幾乎所有十字花科作物,如油菜、卷心菜、甘藍(lán)、大白菜和芥菜等均會受到不同程度的危害[4]。

影響根腫病發(fā)生的因素有很多,其中土壤環(huán)境條件是最為重要的因素,包括土壤含水量、酸堿度和營養(yǎng)元素等,而土壤酸堿度主要取決于土壤溶液中氫離子的濃度。田間根腫病的發(fā)生與土壤p H有密切關(guān)系,從休眠孢子萌發(fā)到根毛侵入時期即初級游動孢子時期是病原菌生活史中最易受到p H影響的時期[5-6]。目前,環(huán)境污染及大量酸性肥料的施用造成的土壤酸化是根腫病發(fā)生嚴(yán)重的主要原因[1]。為進(jìn)一步了解p H對根腫病發(fā)生的影響,本試驗通過設(shè)置不同的土壤p H,觀察根腫菌的侵染發(fā)育,明確p H對病菌各階段的作用及對病害發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為對蕓薹根腫菌高感品種‘魯白六號83-2’大白菜。病原為采自湖北省宜昌市當(dāng)陽兩河鎮(zhèn)雙龍村的油菜根腫病菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 白菜幼苗的培養(yǎng)

本試驗植株的培養(yǎng)采用沙-營養(yǎng)液栽培法,在大槍頭中種植白菜幼苗(圖1)。培養(yǎng)方法參考Donald的方法[3]并略有改動。培養(yǎng)液p H分別為3.8、4.2、5.0、5.4、6.0、7.0、8.0,同時設(shè)置接種與未接種對照,共14個處理,每個處理設(shè)置3個重復(fù),每1個重復(fù)處理不少于20株苗。營養(yǎng)液每隔3 d補(bǔ)充1次,每星期更換1次,以保障營養(yǎng)液營養(yǎng)成分以及p H的穩(wěn)定性。

圖1 沙-營養(yǎng)液培養(yǎng)法栽培苗長勢Fig.1 The growth of seedlings by using sand-nutrient solution culture method

1.2.2 休眠孢子懸浮液的制備及接種方法

取5 g左右冷凍保存的腫根在水中解凍,沖洗干凈后用75%乙醇表面消毒30 s,然后用勻漿機(jī)打成勻漿,8層紗布過濾;濾液轉(zhuǎn)移到50 m L離心管中, 1 450 g離心15 min,沉淀用無菌水洗2次,懸浮于少量無菌水中;將懸浮液緩慢鋪在10 m L percoll混合液(9 m L percoll+1 m L 8.5%NaCl)表面,然后以1 010 g離心10 min;將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,與40 mL無菌水混合,再于1 450 g離心15 min;將得到的沉淀用無菌水洗3次,最后將沉淀溶于少量無菌水中,置于4℃冰箱備用[7]。

當(dāng)白菜幼苗長至2片子葉時,接種根腫菌。將根腫菌休眠孢子配制成濃度為108個/m L的懸浮液,每植株用800μL菌懸液灌根接種[8]。

1.2.3 根腫菌休眠孢子萌發(fā)觀察

采用醋酸地衣紅染色法[9]觀察休眠孢子萌發(fā)情況。45 m L醋酸與55 m L蒸餾水混合,加熱,緩慢加入地衣紅粉末1 g攪拌溶解后緩緩煮沸,配制成1%醋酸地衣紅染色液,過濾后儲存在棕色瓶中備用。在載玻片上滴1滴孢子懸浮液,自然條件下或酒精燈上微熱干燥,加1滴醋酸地衣紅染液染色2 min,用流水清洗后在顯微鏡下觀察。

1.2.4 根腫菌DNA的提取

在接種后第2天和第3天,剪取適量白菜幼苗根部,水洗干凈后提取基因組DNA。稱取0.5 g左右根組織于研缽中,加入1 mL裂解緩沖液[含400 mmol/L Tris-HCl(p H 8.0),60 mmol/L EDTA(p H 8.0), 15 mmol/L NaCl,1%SDS]浸浴10 min后再進(jìn)行研磨;將研磨液轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管,加入150μL醋酸鉀溶液(p H 4.8)振蕩片刻后,11 000 g離心2 min;將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 m L離心管中,11 000 g重復(fù)離心一次;取上清液加入等體積氯仿∶異戊醇(V∶V =24∶1),5 000 g離心8 min;取上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻后常溫下放置20 min;11 000 g離心4 min,棄上清,沉淀用70%乙醇沖洗2～3次,并在10 000 r/min下離心2 min;棄上清,沉淀風(fēng)干后溶于適量TE。

1.2.5 根腫菌侵染的PCR檢測

采用PCR法,利用檢測根腫菌的特異性引物[10],pb-1b：5'-GTGGTCGAACTTCATTAAATTTGGGCTCTT-3'; pb-2b：5'-TTCACCTACGGAACGTATATGTGCATGTGA-3'檢測植株是否被根腫菌侵染。反應(yīng)體系：模板DNA 1μL、引物pb-1b、pb-2b(10 mmol/L)各1μL、2 ×Taq PCR Master Mix 12.5μL、dd H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s, 65℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35循環(huán);最后72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠在120 V恒壓下電泳30 min檢測,經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外光下觀察電泳結(jié)果。

1.2.6 根毛侵染觀察

接種后每天每處理拔取3株幼苗,根系先用自來水沖洗干凈,自根系下胚軸以下1 cm處剪取根系1 cm,置于乙酸-乙醇(V∶V=1∶1)固定液中固定5～10 min,然后再置于苯酚苯胺藍(lán)染液中染色1 min左右,在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察100個根毛侵染情況。

1.2.7 病害調(diào)查

洗根調(diào)查：播種后35 d發(fā)病情況基本穩(wěn)定,將每個處理的幼苗拔出并洗根,洗根時注意不能損傷小的側(cè)根,根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

分級標(biāo)準(zhǔn)[11]：0級,根部無腫瘤,根系發(fā)育正常;1級,側(cè)根著生少許腫瘤或主根稍有膨粗,有小但肉眼清晰可見的結(jié)節(jié)狀腫塊;3級,主根著生腫瘤,有明顯的較大結(jié)節(jié)狀或球狀腫塊;5級,主根上出現(xiàn)大的腫瘤,膨大成紡錘形,大的根腫一直延伸到下胚軸,植株矮小,生長停止;7級,主根形成很大紡錘形腫瘤,植株生長發(fā)育停止,并伴有萎蔫死亡。根據(jù)病情調(diào)查結(jié)果按下式計算病情指數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 p H對休眠孢子萌發(fā)的影響

以不同p H的營養(yǎng)液處理休眠孢子,在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)2 d和6 d,利用醋酸地衣紅定量檢測休眠孢子萌發(fā)率,已萌發(fā)的孢子不著色,未萌發(fā)的則被染成紅色。結(jié)果顯示,培養(yǎng)時間延長有利于孢子萌發(fā),隨著p H的升高,休眠孢子的萌發(fā)率呈先升高后降低的趨勢。其中,p H為6.0時休眠孢子萌發(fā)率最高,培養(yǎng)2 d和6 d的萌發(fā)率分別為46.72%和53.96%,其他p H處理條件下萌發(fā)率相對較低(圖2)。表明中偏酸性條件有利于根腫菌休眠孢子的萌發(fā),而強(qiáng)酸性和堿性條件則抑制休眠孢子萌發(fā)。

圖2 不同p H處理下休眠孢子的相對萌發(fā)率Fig.2 The relative germination rate of resting spores in the solution at different p H values

2.2 PCR法檢測蕓薹根腫菌的侵染情況

接種后第2天和第3天,采用PCR方法檢測根腫菌的侵染情況。結(jié)果顯示,接種后第2天,在土壤p H 3.8、4.2、5.0、5.4和6.0的條件下培養(yǎng)的幼苗中檢測到根腫菌。接種后第3天所有土壤p H處理的幼苗都感染了根腫菌(表1),但p H 8.0處理的條帶沒有其他處理亮。根據(jù)試驗結(jié)果認(rèn)為,土壤為酸性時利于根腫菌侵染,而堿性時可延緩其侵染。

表1 接種后2 d和3 d根腫菌侵染情況的PCR檢測結(jié)果1)Table 1 Results of Plasmodiophora brassicae infection two and three days after inoculation

2.3 p H對根腫菌侵染根毛的影響

接種后每天取樣,在光學(xué)顯微鏡下觀察根毛被侵染的情況。結(jié)果顯示,p H 3.8、4.2、5.0、5.4、6.0、7.0處理其根毛都受到根腫菌侵染,且都發(fā)現(xiàn)了游動孢子囊。p H為8.0時,只發(fā)現(xiàn)少數(shù)根毛受到侵染,且都為初始原生質(zhì)團(tuán),沒有發(fā)現(xiàn)游動孢子囊;此外,有些受到侵染的根毛中原生質(zhì)團(tuán)變形凝結(jié)成球,而不是分裂形成游動孢子囊(圖3)。因此,推測堿性條件使初級原生質(zhì)團(tuán)不能正常分裂或延遲形成游動孢子囊,從而影響了根腫菌的侵染和發(fā)育,進(jìn)而抑制了腫根的形成。

圖3 根腫菌對根毛的侵染觀察Fig.3 The observation of root hairs infected by Plasmodiophora brassicae

2.4 土壤p H對根腫病發(fā)生的影響

利用休眠孢子懸浮液灌根法,將根腫菌接種到不同p H沙-營養(yǎng)液培養(yǎng)的大白菜根部,觀察根腫病發(fā)生危害情況。未接種處理的結(jié)果顯示,土壤p H 3.8或8.0對根系生長有一定的影響,而酸性或中性條件根系生長健康;接種根腫菌的結(jié)果顯示,不同土壤p H對根系及腫瘤形成的影響明顯不同,在品種、栽培管理等相同條件下,酸性土壤較堿性土壤發(fā)病重。堿性(p H 8.0)對根系生長雖略有影響,但不形成腫瘤。隨著p H的降低,白菜根腫病根部腫大情況逐漸明顯,其中當(dāng)p H為5.4、5.0、4.2時,根部明顯腫大呈圓球形,p H 5.0處理下,大白菜根部有少量部分變?yōu)楹谏?qiáng)酸時(p H 3.8)根系少而短小,且變形(圖4)。表明p H相對越低,根部腫大情況越明顯,p H相對越高,根部腫大情況越不明顯。

圖4 p H與白菜根部腫大情況的關(guān)系Fig.4 The relationships between p H and knots on Chinese cabbage root

不同p H處理下,白菜根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)也有差異。結(jié)果顯示,隨著p H的升高,發(fā)病率和病情指數(shù)均呈先上升后下降趨勢,不同處理之間差異顯著(圖5)。當(dāng)p H為5.0時,發(fā)病率和病情指數(shù)最高,分別為71.54%和35.87,其他處理較低。當(dāng)p H為7.0～8.0時白菜發(fā)病輕,p H 8.0時無明顯癥狀表現(xiàn)。說明p H相對較低時,發(fā)病嚴(yán)重,堿性時則不利于發(fā)病。

圖5 p H對白菜根腫病發(fā)病率與病情指數(shù)的影響Fig.5 The influence of p H on Chinese club root’s incidence and disease index

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外研究表明,土壤p H與田間根腫病的發(fā)生有密切關(guān)系。由于富有食品工廠沉積物堆肥(food factory sludge compost,FSC)的施用,導(dǎo)致土壤p H由6.0變?yōu)?.9,根際土壤中休眠孢子萌發(fā)率和根毛感染率顯著減少,農(nóng)家肥(farmyard manure, FYM)和FSC與易感病土壤混合(2.5%,W/W)可抑制病害感染,其中適宜的FSC微粒(≤5 mm)抑制感染作用明顯,且相對更有效地提高了土壤的p H[12]。休眠孢子在弱酸條件下萌發(fā)情況較好,最適p H為6.0～6.7,以p H 6.3時萌發(fā)率最高,堿性或中強(qiáng)酸性時休眠孢子的萌發(fā)率較低[1]。羅一帆等人的研究發(fā)現(xiàn),不同油菜品種發(fā)生根腫病時,根毛侵染最適p H有所不同,其中‘黃油菜’、‘豐抗70’、‘白油菜’和‘川油21’等4個品種根毛侵染高峰p H分別是5.6、4.9、4.9和5.6[13]。羅春紅研究表明：適宜根腫病發(fā)生的p H為6.2,p H 8.0以上發(fā)病少[14],而余漢清等認(rèn)為土壤p H與發(fā)病率無關(guān)[15]。

本研究設(shè)置不同p H梯度,系統(tǒng)明晰了根腫菌侵染與病害發(fā)生隨p H的變化趨勢。隨著p H升高,休眠孢子萌發(fā)率、發(fā)病率與病情指數(shù)均呈先上升后下降趨勢。p H為6.0時休眠孢子萌發(fā)率最高, p H過低不利于孢子萌發(fā)。雖然休眠孢子萌發(fā)率在p H5.0時為6.0時的50%,但p H 5.0處理的病情指數(shù)與發(fā)病率最高,說明酸性條件利于病害發(fā)生主要作用于休眠孢子萌發(fā)后期。p H 7.0處理休眠孢子萌發(fā)率、病情指數(shù)與發(fā)病率明顯降低,且根系生長健康,根部腫大不明顯。p H為8.0時病情指數(shù)與發(fā)病率均為0,休眠孢子萌發(fā)率和根毛侵染率最低,且發(fā)現(xiàn)有些根毛中的原生質(zhì)團(tuán)變形凝結(jié)成球狀,一定程度上說明堿性條件是通過干擾和延遲游動孢子囊的形成以及影響皮層侵染來降低病害的發(fā)生,但該處理植株生長矮小,亦不可作為防病參考依據(jù)。因此,在田間管理上可通過適當(dāng)施加生石灰、有機(jī)肥等提高土壤的p H至中性或弱堿性,創(chuàng)造不利于根腫病菌侵染的條件,進(jìn)而減輕根腫病的危害。

[1] Dixon G R.Plasmodiophora brassicae in its environment[J]. Journal of Plant Growth Regulation,2009,28(3)：212-228.

[2] Landry B S,Hubert N,Crête R,et al.A genetic map for Brassica oleracea based on RFLP markers detected with expressed DNA sequences and mapping of resistance genes to race 2 of Plasmodiophora brassicae(Woronin)[J].Genome,1992, 35(3)：409-420.

[3] Donald E C,Cross S J,Lawrence J M,et al.Pathotypes of Plasmodiophora brassicae,the cause of clubroot,in Australia [J].The Annals of Applied Biology,2006,148(3)：239-244.

[4] 徐瑞英,徐瑞芹.十字花科根腫病的發(fā)生與防治[J].吉林蔬菜,2006(2)：41-42.

[5] Kageyama K,Asano T.Life Cycle of Plasmodiophora brassicae [J].Journal of Plant Growth Regulation,2009,28(3)：203-211.

[6] Donald E C,Porter I J.A sand-solution culture technique used to observe the effect of calcium and p H on root hair and cortical stages of infection by Plasmodiophora brassicae[J].Australasian Plant Pathology,2004,33(4)：585-589.

[7] 郭向華,肖崇剛.甘藍(lán)根腫病菌的生物學(xué)特性及致病研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2001.

[8] 周永紅,孫保亞,沈向群.大白菜根腫病抗病接種濃度的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(3)：34-35.

[9] Naiki T,Dixion G R,Ikegami H.Quantitative estimation of spore germination of Plasmodiophora brassicae[J].Transactions of the British Mycological Society,1987,89(4)：569-609.

[10]Cao T,Srivastava S,Rahman M H,et al.Proteome-level changes in the roots of Brassica napus as a result of Plasmodiophora brassicae infection[J].Plant Science,2008,174(1)：97-115.

[11]張振海.十字花科蔬菜對根腫病的抗感性及病菌侵染寄主的組織學(xué)觀察[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[12]Niwa R,Kumei T,Nomura Y,et al.Increase in soil p H due to Ca-rich organic matter application causes suppression of the clubroot disease of crucifers[J].Soil Biology&Biochemistry, 2007,39：778-785.

[13]羅一帆,劉勇,張敏.蕓薹根腫菌致病影響因子及其侵染類型劃分研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[14]羅紅春.蕓薹根腫菌生活史研究——病原菌的侵染[D].重慶：西南大學(xué),2013.

[15]余漢清,華秀麗.大白菜根腫病發(fā)生條件與防治[J].長江蔬菜, 1996(10)：18-19.

(責(zé)任編輯：田 喆)

Effects of pH on Plasmodiophora brassicae infection and disease development

Ban Jiejing, Hou Mingsheng, Cai Li

(College of Plant Science&Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

A series of p H gradients were set up in order to investigate the effects of p H on Plasmodiophora brassicae infection and disease development.The results indicated that P.brassicae infection speed was higher under the acid conditions than under alkaline conditions.The highest germination rate of spore was 53.96%at p H 6.0.However,strong acidic and alkaline conditions inhibited germination of resting spores.Alkaline condition could make primary protoplasts deformed and condensed into globular shape.The primary protoplasts could not divide properly or delayed forming a zoosporangium.So the infection of P.brassicae was suppressed.Incidence and disease index increased with p H,with the highest level at p H 5.0,followed by the decrease.The incidence and disease index were lower at p H 7.0-8.0.So,the suitably low p H could promote the disease by acting on the resting spore germination and infection. However neutral or alkaline conditions might interfere with this process and reduced disease development.

cruciferous vegetable clubroot; Plasmodiophora brassicae; soil p H

S 436.341.19

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.009

2014-10-20

2014-11-29

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003029)

*通信作者 E-mail：caili@mail.hzau.edu.cn