枯草芽胞桿菌胞外抗菌蛋白的初步分離及性質(zhì)的研究

黃 娜, 周莉質(zhì), 費(fèi) 丹, 施揚(yáng)瑋, 徐 輝, 檀根甲

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,合肥 230061)

枯草芽胞桿菌胞外抗菌蛋白的初步分離及性質(zhì)的研究

黃 娜, 周莉質(zhì), 費(fèi) 丹, 施揚(yáng)瑋, 徐 輝, 檀根甲*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,合肥 230061)

土壤中分離的枯草芽胞桿菌,其發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌具有很強(qiáng)的抑制作用。為了確定其抑菌物質(zhì)的主要成分,本試驗(yàn)采用硫酸銨分級(jí)沉淀獲得無(wú)菌濾液中的抗菌蛋白粗提物,超濾后經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳,膠帶回收進(jìn)行分離鑒定,得到1種具有抑菌活性的蛋白條帶。該蛋白對(duì)供試的6種植物病原真菌具有抑制作用,該蛋白的活性表現(xiàn)在80℃,30 min仍有抑菌作用,對(duì)p H(4～7)具有一定的適應(yīng)范圍、另外對(duì)紫外照射(0～12 h)、抑制劑、有機(jī)溶劑均不敏感。質(zhì)譜鑒定該條帶含有兩種蛋白,分別為假定蛋白BSU35980 gi|16080651,相對(duì)分子量11 079 Da,等電點(diǎn)4.78,匹配率為68%;絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶gi|16080743,相對(duì)分子量為45 575 Da,等電點(diǎn)為5.56,匹配率為67%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)抑菌蛋白可以使菌絲發(fā)生斷裂、扭曲、畸形、腫大。

枯草芽胞桿菌; 凝膠電泳; 理化性質(zhì); 質(zhì)譜鑒定

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)是一種常見(jiàn)的植物內(nèi)生菌,也是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群,它具有很強(qiáng)的抗逆能力和抑菌作用[1],許多被分離的植株都已經(jīng)成功地用于植物病害的生物防治[2]。如蔣躍明采用枯草芽胞桿菌培養(yǎng)液和多抗霉素處理荔枝果實(shí),可以有效地防治荔枝霜霉侵染引起的貯藏病害,以?xún)烧呋旌咸幚硇Ч詈肹3];趙白鴿、孔建等用枯草芽胞桿菌B-903防治蘋(píng)果輪紋病取得了很好的防效[4]。它的抑菌機(jī)理包括競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性等。已報(bào)道的有抑菌作用的物質(zhì)包括低分子量抑菌肽[5]、抑菌蛋白[6]和揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[7]等。

本試驗(yàn)從土壤中分離的枯草芽胞桿菌,使用硫酸銨分級(jí)沉淀法從該菌胞外代謝液中分離粗蛋白,并用聚丙烯胺凝膠電泳切膠回收初步純化粗蛋白,得到一種抗菌蛋白條帶,對(duì)該蛋白條帶的抗真菌活性和部分理化性質(zhì)進(jìn)行了研究,并用質(zhì)譜鑒定了該蛋白的結(jié)構(gòu),為以后的基因工程研究和生物農(nóng)藥研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)本試驗(yàn)也觀察了抑菌蛋白對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響,為以后的抑菌機(jī)理的深入研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 拮抗細(xì)菌

枯草芽胞桿菌(B.subtilis)從土壤中分離,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試病原菌

蘋(píng)果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum),由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

細(xì)菌固體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)(蛋白胨1%,牛肉膏1%,氯化鈉0.5%,瓊脂粉15～20 g,p H 7.2～7.4);液體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(NB);真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉15～20 g)。

1.2 枯草芽胞桿菌發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的分離

1.2.1 枯草芽胞桿菌發(fā)酵液制備

從斜面培養(yǎng)基中挑取菌體接入NB液體培養(yǎng)基中,28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,配制成細(xì)菌發(fā)酵液。4℃,8 000 r/min,離心30 min,去掉沉淀,用0.45μm濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液,得到無(wú)菌濾液,即為抑菌物質(zhì)粗提物。

1.2.2 硫酸銨沉淀法提取粗蛋白

向無(wú)菌濾液中加入硫酸銨。4℃靜置12 h,然后4℃,8 000 r/min,離心30 min。將沉淀溶于0.02 mol/L、p H 7.4的磷酸緩沖液中,即得到粗提蛋白。利用微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白的濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的純化

1.3.1 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的超濾濃縮

將粗提蛋白緩慢加入截留分子量為3 k Da容積為5 m L的超濾離心管,5 000 r/min,4℃離心40 min后,向離心管中加入2 m L超純水,重復(fù)上述步驟3～4次,當(dāng)離心管中液體少于200μL時(shí),順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打,混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然后吸取濃縮液,直到吸完。收集濃縮除雜的樣品,用0.45μm的細(xì)菌過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行除菌處理,利用微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白的濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 枯草芽胞桿菌粗提蛋白的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制10%的分離膠10 m L,迅速沿著玻璃壁灌入玻璃板的縫隙至開(kāi)口處,加上一層超純水壓平凝膠上端,靜置30 min,灌注5%的層積膠至玻璃板頂端,插入梳子,室溫下靜置聚合30 min以上。待層積膠完全凝固后,拔出梳子,倒入非變性電泳緩沖液,取超濾得到的蛋白樣品上樣8個(gè)孔,每孔大約上樣30μL。然后電泳,先用70 V恒壓運(yùn)行30 min,再100 V恒壓運(yùn)行2 h,停止電泳,整個(gè)操作過(guò)程保持恒溫4℃,以防止蛋白質(zhì)變性。剝膠后先用超純水清洗,把凝膠兩邊的兩個(gè)泳道的條帶切去進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色和快速脫色(40%甲醇和10%乙酸),剩余的凝膠置于4℃冰箱保存。

1.3.3 蛋白條帶的切膠回收

將凝膠放置在白色底板上以增強(qiáng)顏色對(duì)比效果,使蛋白條帶更易于辨認(rèn)。將脫色后的膠條中目的蛋白質(zhì)區(qū)間與未染色的凝膠中相應(yīng)區(qū)間相互對(duì)應(yīng),推斷出未染色凝膠中目的蛋白質(zhì)的大致位置,用無(wú)菌刀片切下含蛋白質(zhì)的膠條,逐一將膠條置于無(wú)菌研缽中充分研磨,收集研磨后的碎膠塊置于50 m L離心管中,加入適量的非變性電泳緩沖液,混勻后將離心管置于4℃冰箱中。多次浸泡使回收率最大。然后將樣品冷凍干燥濃縮,-20℃冰箱保存,使用前將其用無(wú)菌水配制成蛋白濃度為

0.02 mg/m L。

1.3.4 回收的膠條抑菌活性的檢測(cè)

采用PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)分離的各個(gè)條帶蛋白質(zhì)的抑菌活性,配制蘋(píng)果炭疽病菌分生孢子懸浮液1×105個(gè)/m L,均勻地涂在PDA平板上,用無(wú)菌打孔器在平板上均勻打孔,在孔中分別加入50μL樣品,放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,根據(jù)樣品周?chē)志Φ拇笮〈_定樣品對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌抑制作用,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 抑菌蛋白對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

根據(jù)PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)法,選取抑菌圈最大的一個(gè)部分,用接種環(huán)挑取與炭疽病菌菌塊交界處的菌絲于顯微鏡下觀察,以正常的菌絲作對(duì)照。

1.3.6 抑菌蛋白對(duì)其他5種病原菌的抑制作用

采用PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)法,在活化的病原真菌平板上用滅菌打孔器(直徑為5 mm)制備菌餅,將菌餅接在PDA平板上,同時(shí)用無(wú)菌打孔器在菌餅周邊等距離的位置打孔,在孔中加入50μL樣品。在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d,根據(jù)樣品周?chē)z的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組的比較,確定對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。

1.4 抑菌蛋白的理化性質(zhì)

1.4.1 溫度對(duì)蛋白質(zhì)抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別在20、40、60、80、100、121℃處理30 min,分別以不做處理的蛋白溶液和無(wú)菌水作為對(duì)照,以蘋(píng)果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對(duì)峙法測(cè)定抑菌圈直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌圈直徑(mm)=對(duì)照的菌落直徑-處理組的菌落直徑;下同。

1.4.2 p H對(duì)蛋白質(zhì)抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用0.1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,分別用不做處理的蛋白溶液和無(wú)菌水作為對(duì)照,以蘋(píng)果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對(duì)峙法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.3 紫外照射對(duì)蛋白抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用紫外照射0、2、4、6、8、10、12 h,分別用不做處理的蛋白溶液和無(wú)菌水作為對(duì)照,以蘋(píng)果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對(duì)峙法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.4 抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別用0.5 mg/mL EDTA、0.002 mg/ mL SDS、6 mg/mL DDT等體積混合,分別用加無(wú)菌水的蛋白溶液和無(wú)菌水作為對(duì)照,以蘋(píng)果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對(duì)峙法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.5 有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)抑菌活性的影響

將蛋白溶液分別與丙酮、氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯等體積混合后,分別用加無(wú)菌水的蛋白溶液和無(wú)菌水作為對(duì)照,以蘋(píng)果炭疽病菌為指示菌,采取平皿對(duì)峙法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 抑菌蛋白的質(zhì)譜技術(shù)鑒定

將抑菌蛋白進(jìn)行酶解,抽提酶解肽段,ESI質(zhì)譜,然后用軟件分析數(shù)據(jù),對(duì)質(zhì)譜鑒定的原始譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)峰,得到帶有質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度信息的peaklist文件,對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和理論譜進(jìn)行質(zhì)量上的匹配和打分,最后從鑒定的肽段中得到鑒定蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽胞桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的分離及其對(duì)蘋(píng)果炭疽菌的抑制作用

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶(圖1)顯示,該粗提蛋白含有6種蛋白。抑菌結(jié)果(圖2)表明,只有6號(hào)條帶對(duì)蘋(píng)果炭疽菌具有抑菌作用。

圖1 粗蛋白的非變性聚丙烯胺凝膠電泳Fig.1 PAGE of crude proteins

圖2 回收蛋白條帶對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of Colletotrichum gloeosporioides by recovered proteins

顯微觀察蘋(píng)果炭疽病菌菌絲經(jīng)蛋白處理后,菌絲形態(tài)如圖3所示,正常的菌絲形狀比較規(guī)則,細(xì)長(zhǎng),而經(jīng)蛋白處理后的菌絲發(fā)生斷裂、扭曲、畸形、腫大。

圖3 抗菌蛋白對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.3 Effects of antifungal proteins on Colletotrichum gloeosporioides mycelia

2.2 抑菌蛋白對(duì)其他病原菌菌絲的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明,該抑菌蛋白對(duì)小麥赤霉病菌(F.graminearum)、小麥紋枯病菌(R.cerealis)、水稻紋枯病菌(R.solani)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用。

圖4 抑菌蛋白對(duì)5種病原菌菌絲的抑制作用Fig.4 The inhibition of five pathogenic fungus mycelia by antifungal proteins

表1 不同處理?xiàng)l件對(duì)蛋白質(zhì)抑菌活性的影響1)Table 1 Influences of different conditions on the bacteriostatic activity of proteins

2.3 抑菌蛋白的理化性質(zhì)

由表1可以看出,抑菌蛋白在20～60℃處理30 min的情況下,其活性沒(méi)有明顯的變化,80℃處理30 min雖然有所下降,但仍具有抑菌作用,說(shuō)明該蛋白具有一定的耐熱性;抑菌蛋白在p H 4～7抑菌活性保持穩(wěn)定,當(dāng)p H高于7時(shí),抑菌活性有所下降;紫外照射和經(jīng)抑制劑、有機(jī)溶劑處理對(duì)抑菌蛋白的抑菌活性均沒(méi)有影響。上述結(jié)果表明,該抑菌蛋白具有較好的穩(wěn)定性。

2.4 抑菌蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)

對(duì)蛋白6號(hào)條帶做質(zhì)譜解析,結(jié)果(圖5)所示,峰上標(biāo)有數(shù)字(m/z值)的表示相應(yīng)的峰有肽段匹配上;峰強(qiáng)度小于最大強(qiáng)度的5%時(shí)用粗體表示。數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)結(jié)果(表2)所示,表中的分值為鑒定結(jié)果得分,由Mascot數(shù)據(jù)分析軟件檢測(cè)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌全庫(kù),通過(guò)計(jì)算得出分值在65分以上的結(jié)果可信(P＜0.05)。本結(jié)果有2種蛋白的分值超過(guò)65,分別為假定蛋白BSU35980、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶,2種蛋白肽段的完整信息如表3所示,粗體標(biāo)注的表示試驗(yàn)肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白理論肽段匹配的序列。

圖5 蛋白質(zhì)條帶6的一級(jí)PMF譜圖Fig.5 The PMF of No.6 protein

表2 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)條帶6回收結(jié)果Table 2 The identification results of shot-gun for protein recovered from No.6 of Native-PAGE

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)于枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的研究已有相關(guān)報(bào)道。如沈錦玉等[8]通過(guò)濃鹽酸沉淀、乙醇抽提、離子交換層析和高效液相色譜法對(duì)枯草芽胞桿菌B115進(jìn)行分離純化,最終得到分子量為803.6 Da的抑菌物質(zhì)。黃麗麗等[9]通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析、PAGE切膠電洗脫、陰離子交換層析從EIR-j發(fā)酵液中分離純化得到分子量為51.9 k Da的抗菌蛋白j1。

本試驗(yàn)采取硫酸銨沉淀法、超濾濃縮、聚丙烯酰胺凝膠電泳切膠回收以及抑菌試驗(yàn)得到抗菌蛋白,結(jié)果表明：該抗菌蛋白對(duì)供試的6種植物病原真菌具有抑制作用;該蛋白經(jīng)80℃處理30 min仍有抑菌作用,對(duì)p H(4～7)具有一定的適應(yīng)范圍、對(duì)紫外照射(0～12 h)、抑制劑、有機(jī)溶劑均不敏感;顯微觀察發(fā)現(xiàn)它可以使菌絲發(fā)生斷裂、扭曲、畸形、腫大;質(zhì)譜鑒定,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)該蛋白條帶中含有Hypothetical protein BSU35980、Serine hydroxymethyltransferase兩種蛋白。但是,是哪種蛋白具有抑菌作用,筆者正嘗試對(duì)這兩種蛋白進(jìn)行單克隆表達(dá),然后分別做抑菌試驗(yàn)進(jìn)行分析。

表3 兩種蛋白質(zhì)點(diǎn)對(duì)應(yīng)肽段的完整信息Table 3 Complete information of peptides of two proteins

[1] 檀根甲,李增智,劉淑芳,等.枯草芽孢桿菌BS80-6對(duì)蘋(píng)果采后炭疽病的控病效果及作用機(jī)制[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2008, 35(3)：227-232.

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Primary separation of an extracellular antifungal protein from Bacillus subtilis

Huang Na, Zhou Lizhi, Fei Dan, Shi Yangwei, Xu Hui, Tan Genjia

(College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230061,China)

Bacillus subtilis was isolated from the soil,and the fermentation liquid had strong inhibitory action against Colletotrichum gloeosporioides.In order to identify the antimicrobial compounds,the antimicrobial substances were isolated and purified by(NH4)2SO4fractional precipitation,ultrafiltration,PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis,and tape reciting.The results showed that the purified active protein had inhibitory action to 6 plant pathogenic fungi.The protein was found to be stable at 80℃for 30 min.The inhibitory activity of the protein was observed in the range of p H value from 4 to 7,and not sensitive to ultraviolet radiation,inhibitor and organic solvents.Two kinds of proteins contained in this stripe were identified by mass spectrum.They were the hypothetical protein BSU35980 gi|16080651,with a relative molecular mass of 11 079 Da and isoelectric point (p I)of 4.78,and a matching ratio of 68%,and serine hydroxymethyltransferase gi|16080743,with a relative molecular mass of 45 575 Da and isoelectric point(p I)of 5.56,and a matching ratio of 67%.Microscope observation revealed that the protein could break up and enlarge the mycelia.

Bacillus subtilis; PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis; physiochemical property; mass spectrum identification

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.008

2014-11-09

201503-04

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)科研項(xiàng)目(KJ2007A095)

*通信作者 E-mail：tgj63@163.com