短梗霉素A對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的影響

趙紅霞, 茍 萍, 劉小平, 劉圣紅, 郭星軍

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046)

短梗霉素A對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的影響

趙紅霞, 茍 萍*, 劉小平, 劉圣紅, 郭星軍

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046)

通過(guò)考察短梗霉素A(Ab A)對(duì)灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1及其AUR1基因內(nèi)含子缺失突變株Bc AUR1a生長(zhǎng)的影響,明確Ab A抑制真菌生長(zhǎng)的機(jī)理。Ab A敏感性試驗(yàn)表明,低濃度Ab A(8μg/m L)顯著抑制野生株Bc AUR1菌體的生長(zhǎng),高濃度Ab A(50μg/mL)存在下觀察不到Bc AUR1的生長(zhǎng)跡象。突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響,在低濃度和高濃度Ab A存在下均能正常生長(zhǎng)。Ab A抑制Bc AUR1侵染柑橘果實(shí),但Bc AUR1a在高濃度Ab A存在下也能夠有效感染柑橘果實(shí)。這兩個(gè)試驗(yàn)均證實(shí)了突變株Bc AUR1a具有Ab A抗性。電鏡觀察表明,Ab A引起B(yǎng)c AUR1細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常,質(zhì)膜和液泡膜斷裂,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露。Ab A抑制灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的機(jī)制是由于IPC合成酶受到抑制,導(dǎo)致鞘磷脂類(lèi)物質(zhì)合成不足,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,胞內(nèi)物質(zhì)外漏。

灰葡萄孢菌; IPC合成酶; 短梗霉素A; 細(xì)胞形態(tài)

灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起,是一種世界范圍內(nèi)的農(nóng)作物及果蔬病害?；移咸焰呔募闹鞣秶軓V,能侵染多種糧食作物、蔬菜、水果和觀賞植物的葉、莖、花和果實(shí)[13]?；颐共〔粌H在田間造成危害,而且在貯運(yùn)、銷(xiāo)售和消費(fèi)期間繼續(xù)造成果蔬發(fā)病腐爛,嚴(yán)重影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量,造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前化學(xué)防治仍然是灰霉病防治的主要措施,但由于灰葡萄孢菌具有遺傳變異大、繁殖速率快和適應(yīng)性強(qiáng)等特性,連續(xù)多年大量使用單一作用位點(diǎn)的殺菌劑,很容易形成對(duì)特定殺菌劑具有抗性的亞群體,其結(jié)果是防治效果下降,甚至失效[4-6]?；移咸焰呔饕秩竟叩目墒巢糠?殺菌劑的廣泛使用,帶來(lái)各種問(wèn)題,如農(nóng)藥殘留導(dǎo)致人畜安全受到威脅,傷害環(huán)境中其他微生物引起生態(tài)平衡失調(diào)等。人們一直試圖尋找一種對(duì)真菌高效、與已有藥劑沒(méi)有交互抗性、對(duì)人類(lèi)安全的新型殺菌劑。

鞘脂是真核生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要成分,是維持真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可缺少的組分。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明,鞘脂及其代謝產(chǎn)物還是重要的信號(hào)分子,參與膜蛋白的定位和運(yùn)輸,并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、衰老等基本生命活動(dòng)[710]。在鞘脂合成途徑中,哺乳動(dòng)物鞘脂類(lèi)合成最終形成鞘磷脂,植物中形成復(fù)雜神經(jīng)鞘脂質(zhì),而真菌最終形成甘露糖基化的肌醇磷酸神經(jīng)酰胺。因此,神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺(IPC)和甘油二酯的反應(yīng)是真菌鞘脂合成所特有的[11](圖1)。催化這一反應(yīng)的酶,肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶(IPC合成酶)是鞘脂代謝中的關(guān)鍵酶,可作為篩選抗真菌藥物的靶標(biāo)[12]。

圖1 不同生物中鞘脂代謝途徑Fig.1 The sphingolipid metabolic pathways in different organisms

短梗霉素A(aureobasidin A,Ab A)是從出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)R106培養(yǎng)液中分離得到的環(huán)狀九肽抗生素[13],對(duì)真菌和原生動(dòng)物的生長(zhǎng)有廣譜抑制作用?，F(xiàn)已證實(shí)Ab A是真菌AUR1基因編碼的IPC合成酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[14]。Ab A處理和AUR 1基因表達(dá)抑制均引起酵母細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)變化,如微管消失、細(xì)胞周期循環(huán)阻滯,細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)完整性遭到破壞等[15-16]。通過(guò)在酵母等真菌中篩選抗Ab A突變體,發(fā)現(xiàn)突變體能抵抗Ab A引起的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育的異常,酵母AUR1基因158位的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)槔野彼?Tyr)是獲得Ab A抗性的分子機(jī)制[17-19]。

迄今,對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用了解甚少,本試驗(yàn)通過(guò)研究Ab A對(duì)灰葡萄孢菌及其突變體生長(zhǎng)的影響,明確Ab A抑制真菌生長(zhǎng)的機(jī)理,為真菌的防治和開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

灰葡萄孢菌原始菌株Bc AUR1由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院李紅葉教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。灰葡萄孢菌突變菌株Bc AUR1a由本實(shí)驗(yàn)室以Bc AUR1為原始菌株,通過(guò)紫外誘變,Ab A篩選[20]獲得,經(jīng)鑒定和序列測(cè)定發(fā)現(xiàn),該突變菌株AUR 1基因序列中缺失117～231位115 bp的內(nèi)含子序列,但AUR1基因編碼的IPC合成酶的氨基酸序列未發(fā)生突變[21- 22]。

1.1.2 培養(yǎng)基和Ab A母液配制

含Ab A的PDA培養(yǎng)基：待滅菌PDA培養(yǎng)基涼至50℃,依次加入Amp(終濃度為100μg/m L)和Ab A,使Ab A終濃度分別為2、8和50μg/m L,混勻后鋪板;以相應(yīng)濃度的甲醇代替Ab A,作為對(duì)照PDA培養(yǎng)基。

Ab A母液：Ab A購(gòu)自寶生物公司,用甲醇配成濃度為2 mg/m L的母液,存儲(chǔ)在4℃冰箱中,備用。

其他所有試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰葡萄孢菌的培養(yǎng)

保存菌種用平板畫(huà)線法接種于PDA培養(yǎng)基上, 28℃恒溫倒置培養(yǎng)一周,待其菌絲變?yōu)榛疑a(chǎn)生孢子,無(wú)菌水洗下孢子,調(diào)整孢子的濃度為1×107個(gè)/m L,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 灰葡萄孢菌對(duì)Ab A的敏感性測(cè)定

將野生型灰葡萄孢菌及其突變體的孢子懸浮液分別取100μL接種于對(duì)照平板和含不同濃度Ab A的PDA平板上培養(yǎng)6 d,觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 灰葡萄孢菌侵染柑橘試驗(yàn)

先用清水將柑橘表面洗干凈,然后在超凈臺(tái)中依次用無(wú)菌水、70%乙醇清洗,晾干。將柑橘分為4組,每組10個(gè)。用無(wú)菌針在柑橘表皮上刺1個(gè)1 mm左右的傷口,試驗(yàn)組在傷口表面均勻涂布5μL 50μg/m L的Ab A,晾干。對(duì)照組均勻涂布5μL2.5%甲醇。分別將5μL Bc AUR1和Bc AUR1a的孢子懸液(1×107個(gè)/m L)均勻涂布于對(duì)照組和試驗(yàn)組柑橘傷口處,置于保濕器皿中,室溫(20±2)℃下培養(yǎng)4 d,觀察感染情況。

1.2.4 Ab A對(duì)灰葡萄孢菌細(xì)胞形態(tài)的影響

分別將灰葡萄孢菌Bc AUR1孢子懸液接種于含8μg/m L Ab A的PDA平板和對(duì)照平板上,25℃培養(yǎng)3 d。用2.5%的戊二醛溶液4℃固定過(guò)夜,按常規(guī)透射電鏡樣品制備方法制備樣品[23]。將制備好的樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片,獲得70～90 nm的薄片,經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色15 min后,在日本JEOL公司生產(chǎn)的JEM-1230型透射電鏡中觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 AbA敏感性測(cè)定

結(jié)果表明,野生株Bc AUR1在2μg/m L Ab A的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng);Ab A為8μg/m L時(shí),生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制;當(dāng)Ab A濃度達(dá)到50μg/m L時(shí),未見(jiàn)菌體生長(zhǎng)(圖2)。突變株Bc AUR1a在Ab A濃度為2～50μg/m L的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)(圖2),表明突變菌株Bc AUR1a對(duì)Ab A產(chǎn)生了抗性[20]。

圖2 灰葡萄孢菌對(duì)AbA敏感性測(cè)定Fig.2 Determination of the susceptibility of Botrytis cinerea to AbA

2.2 突變株Bc AUR1a對(duì)Ab A處理柑橘的侵染

2.5%甲醇處理的對(duì)照組柑橘全部被野生株Bc AUR1感染(圖3a),50μg/m L Ab A處理的試驗(yàn)組柑橘均未被野生株Bc AUR1感染(圖3b),說(shuō)明Ab A抑制了野生株Bc AUR1對(duì)柑橘的侵染,能夠有效防治柑橘灰霉病的發(fā)生。而突變株Bc AUR1a則對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組柑橘都能侵染[21](圖3c～d),說(shuō)明Ab A不能抑制突變株BCAUR1a對(duì)柑橘的侵染,突變株Bc AUR1a產(chǎn)生了Ab A抗性。

圖3 AbA對(duì)灰葡萄孢菌侵染柑橘的影響Fig.3 Effects of AbA on infection of Botrytis cinerea in citrus

2.3 Ab A對(duì)灰葡萄孢細(xì)胞形態(tài)的影響

未經(jīng)Ab A處理的灰葡萄孢Bc AUR1細(xì)胞壁較厚,細(xì)胞壁表面界限和表面物質(zhì)清晰可見(jiàn);細(xì)胞質(zhì)膜平滑連續(xù),緊貼細(xì)胞壁;內(nèi)膜系統(tǒng)豐富,線粒體膜完整,嵴豐富而粗壯,液泡膜完整,細(xì)胞質(zhì)中富含糖原顆粒(圖4a～b)。在8μg/m L的Ab A作用下,細(xì)胞明顯變小,細(xì)胞壁變薄,細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜表面粗糙不平,皺縮明顯,部分質(zhì)膜和液泡膜破裂;內(nèi)膜系統(tǒng)的部分膜界限不清晰,線粒體腫脹,糖原顆粒和細(xì)胞內(nèi)容物顯著減少[24](圖4c～f)。表明Ab A抑制了IPC合成酶的活性,導(dǎo)致鞘脂類(lèi)合成代謝受阻,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響,質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常,發(fā)生褶皺甚至破裂,造成細(xì)胞內(nèi)糖原和內(nèi)容物泄漏。

圖4 灰葡萄孢菌細(xì)胞形態(tài)的透射電鏡圖片F(xiàn)ig.4 Transmission electron microscopy images of Botrytis cinerea’s morphology

3 討論

Ab A能抑制多種真菌的生長(zhǎng),對(duì)假絲酵母(Candida)、曲霉(Aspergillus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等病原真菌均有抑制作用[2526]。我們通過(guò)Ab A對(duì)灰葡萄孢菌野生株BcAUR1及其AUR1基因但內(nèi)含子缺失的突變株Bc AUR1a抑制作用的研究,也證實(shí)低濃度Ab A(8μg/m L)能夠顯著抑制灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1的生長(zhǎng),高濃度Ab A(50μg/ mL)則完全抑制其生長(zhǎng),但突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響,在高濃度Ab A存在下亦能正常生長(zhǎng)?；移咸焰呔腥靖涕俚脑囼?yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果。這些結(jié)果均表明Ab A通過(guò)抑制IPC合成酶的活性,導(dǎo)致鞘脂合成不足,從而抑制了灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)中突變株BcAUR1a是AUR1基因中缺失內(nèi)含子,產(chǎn)生了AbA抗性,抵抗Ab A對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的抑制,說(shuō)明該內(nèi)含子可能在AUR1基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用,目前已有許多研究表明內(nèi)含子具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能,在其序列中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,起著啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制子的作用[2728]。

鞘磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分,特別是生物膜脂筏(lipid raft)結(jié)構(gòu)中的主要物質(zhì),鞘磷脂還與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞、胞飲等密切相關(guān)[10,29]。本研究發(fā)現(xiàn),Ab A導(dǎo)致灰葡萄孢細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常,質(zhì)膜和液泡膜斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露,從而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步證實(shí)了Ab A使神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺的反應(yīng)受阻,導(dǎo)致鞘磷脂類(lèi)物質(zhì)的合成量不足,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,造成糖原等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露。

綜上所述,Ab A抑制絲狀真菌生長(zhǎng)的機(jī)理是抑制了IPC合成酶的活性,導(dǎo)致鞘磷脂類(lèi)物質(zhì)的合成不足,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Effects of aureobasidin A on Botrytis cinerea’s growth

Zhao Hongxia, Gou Ping, Liu Xiaoping, Liu Shenghong, Guo Xingjun

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

In order to clarify the mechanism of aureobasidin A(Ab A)inhibiting the growth of fungi,the effects of Ab A on the growth of B.cinerea wild strain Bc AUR1 and strain Bc AUR1a with deletion of the intron of AUR 1 gene were investigated.The experiments of Ab A sensitivity showed that low concentration of Ab A(8μg/m L)significantly inhibited the growth of Bc AUR1,and there was no sign of Bc AUR1 growth under high concentrations of Ab A(50μg/m L).However,Ab A had no impacts on Bc AUR1a,which could grow normally at low or high concentrations of Ab A.Additionally,Ab A could inhibit infection of Bc AUR1 to citrus fruits,but Bc AUR1a could infect citrus fruits effectively even at the presence of high concentration of Ab A.Both results confirmed that Bc AUR1a had a resistance to Ab A.The observation by electron microscopy showed that Ab A caused morphological abnormality of Bc AUR1 cell membrane and inner membrane system,the fracture of plasmalemma and tonoplast,and the leakage of intracellular substances.The mechanisms that Ab A inhibited the growth of B.cinerea was that IPC synthetase was inhibited,which caused insufficient synthesis of sphingomyelin substances,damage of cell membrane structure and leakage of intracellular substances.

Botrytis cinerea; inositol phosphatidyl ceramide(IPC)synthase; aureobasidin A; cell morphology

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.007

2014-09-29

2015-02-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160031)

*通信作者 E-mail：gou_ping@sina.com