蘋果屬植物寄主應答病原菌脅迫的蛋白質組學研究進展

張彩霞, 田 義, 張利義, 肖 龍, 宋成秀, 叢佩華

(農業(yè)部園藝作物種質資源利用重點實驗室/中國農業(yè)科學院果樹研究所,興城 125100)

蘋果屬植物寄主應答病原菌脅迫的蛋白質組學研究進展

張彩霞, 田 義, 張利義, 肖 龍, 宋成秀, 叢佩華*

(農業(yè)部園藝作物種質資源利用重點實驗室/中國農業(yè)科學院果樹研究所,興城 125100)

蘋果基因組研究的不斷深入,為蘋果屬植物蛋白質組學研究奠定了基礎。近年來,蛋白質組學分析方法在探討蘋果屬植物應答病原菌脅迫時,所啟動的抗病相關蛋白的差異表達,以及相關抗病機制方面發(fā)揮了重要作用。本文針對近年來蛋白質組學研究技術在果樹上的應用,綜述了蘋果屬植物應答火疫病、褐斑病、黑星病等主要病害脅迫的蛋白質組學研究進展,分析了蛋白質組學分析技術在蘋果屬植物相關研究中存在的問題,以期為進一步探究蘋果屬植物抗病的分子機制提供參考。

蘋果; 病原菌; 蛋白質組學; 研究進展

以往關于模式植物抗病分子機制研究表明,植物寄主應答病原菌脅迫時,寄主細胞自身免疫受體(抗病蛋白)能夠識別病原菌效應因子,進而誘發(fā)寄主細胞自身抗病反應,實現(xiàn)對病原菌脅迫信號的響應、傳遞以及生物學防御[13]。

目前,國內外蘋果產業(yè)已進入快速發(fā)展期,然而,迄今為止,各種病害的發(fā)生仍然是制約蘋果產業(yè)發(fā)展的瓶頸,由此,各國育種部門逐漸關注以提高果樹自身抗性為目標的抗性育種研究[45]。由于蘋果屬多年生木本植物,童期較長、且遺傳背景高度雜合,常規(guī)的育種手段很難在短期內培育出高抗優(yōu)質的新種質。分子生物學技術的不斷發(fā)展和完善,為系統(tǒng)了解蘋果屬植物響應病原菌脅迫的防御反應過程提供了技術參考。近年不斷發(fā)展的基因組學、蛋白質組學研究,使得挖掘抗病相關功能基因或蛋白,并利用基因工程手段加快蘋果抗病種質的遺傳改良研究成為現(xiàn)實。開展植物寄主與病原菌互作的差異蛋白質組學研究,將有助于從分子水平上了解植物寄主應答病原菌脅迫的抗病機制。本文就近年來國內外關于蘋果屬植物應答病原真菌脅迫的蛋白質組學研究作一概述,以期為進一步應用蛋白質組學方法探究蘋果屬植物抗病的分子機制提供參考。

1 植物寄主應答病原菌脅迫的抗病機制

病原菌是導致植物寄主發(fā)病的生物脅迫因子。在自然條件下,植物寄主與病原菌互作涉及復雜的防御反應過程,包括細胞壁增厚、各種抗病相關蛋白的誘導表達及毒素的分泌等[1,6-7]。此外,植物寄主應答病原菌侵染的抗病或感病反應與其自身的免疫系統(tǒng)相關,包括寄主與病原菌間的相互識別、相互競爭[1]。通過對胡椒、煙草等植物的抗病分子機制研究發(fā)現(xiàn),植物寄主應答病原菌脅迫時,常通過寄主細胞內某些抗性相關蛋白的特異性表達,影響或抵御病原菌的進一步侵染[3,8]。

圖1 寄主植物響應病原菌脅迫過程中可能涉及表達的抗性相關蛋白[1,10]Fig.1 Resistance-related proteins of host plants in response to pathogens attack[1,10]

抗病反應涉及多種抗性相關蛋白的表達,如病程相關蛋白(pathogenesis related protein,PR)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、熱激蛋白(Hsp)、氧化脅迫反應相關蛋白以及其他次生代謝蛋白等(圖1)[1,10]。

其中,PR類蛋白是植物寄主在抗病反應過程中產生的一類具有廣譜抗性的可溶性蛋白[1,910],目前,關于其基因表達調控的分子機制研究取得了很大進展[3,8]。根據PR蛋白的植物來源、氨基酸序列同源性以及生化功能等,可將PR蛋白分為17類[11],包括：富含甘氨酸的PR蛋白(PR-1)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1, 3-glucanases)(PR-2)、幾丁質酶(chitinase)(PR-3)、類甜蛋白(thaumatin-like protein)(PR-5)、過氧化物酶類(peroxidases)(PR-9)、過敏反應相關的PR蛋白(PR-10)等。研究表明,其中的PR-2、PR-3、PR-5以及PR-9等PR類蛋白能有效抑制病原菌的生長和擴散,已被鑒定為具有潛在抗真菌活性的抗病蛋白[1,3,810]。

研究表明,寄主細胞內PR類蛋白的特異性表達對病原菌致病能力的發(fā)揮具有重要影響。目前,植物寄主響應病原真菌脅迫的蛋白質組學研究在擬南芥、水稻、玉米、番茄等模式植物中已得到廣泛開展,大量的抗病相關蛋白已被成功鑒定[12- 15]。

2 蛋白質組學研究技術在果樹研究中的應用

近年來,隨著功能基因組學研究方法的不斷發(fā)展,蛋白質組學(proteomics)技術作為功能基因組學研究的重要支柱,已成為分子生物學領域的前沿學科,其技術的日趨成熟與完善,已能實現(xiàn)在蛋白質水平上以高通量方式直接研究基因功能[10,16]。

相較于穩(wěn)定的基因組信息,蛋白質組具備其動態(tài)變化的特殊性,如結構的形成、修飾、定位、相互作用等,這些信息均無法直接從基因組信息中獲得。因此,若要精確地研究基因的功能,解釋復雜的生命現(xiàn)象,就必然要在定量、整體、動態(tài)的水平上對基因表達產物(蛋白質)進行研究,即進行蛋白質組學的研究[17]。蛋白質組學研究的不斷發(fā)展,也為蘋果屬植物相關研究創(chuàng)造了良好的技術體系。

近幾年,隨著果樹基因組研究工作的不斷深入和完善,蛋白質組學分析技術已經應用于梨[18]、桃[19]、香蕉[20]等多年生果樹品種研究上,關于蘋果屬植物材料蛋白質組學方面的研究也已陸續(xù)開展[21-25]。2010年公布了‘金冠’(Golden delicious)蘋果的全基因組草圖[26],其測序結果所產生的海量數據,為蘋果屬植物蛋白質組學、基因組學等相關研究的開展奠定了重要基礎。

蘋果果皮較薄,采摘前后很容易受到機械損傷,而形成的傷口又為其他病原菌的侵染制造了機會。Buron-Moles等[27]以‘金冠’蘋果為研究對象,分析了機械傷害處理前后,果實總蛋白的差異表達情況。研究發(fā)現(xiàn),果實經機械傷害處理48 h后,其差異表達蛋白主要為脅迫反應相關蛋白,包括β-1,3-葡聚糖酶等病程相關的PR類蛋白,該研究為充分認識蘋果屬植物應答機械損傷脅迫的抗性機制提供參考。

3 蘋果屬植物應答病原菌脅迫的蛋白質組學研究

目前,利用成熟的蛋白質組學分析技術,在蘋果屬植物寄主應答病原菌研究中,已篩選獲得大量由病原菌誘導產生,來源于寄主的功能蛋白。此外,還明確了各類蛋白,尤其是病程相關PR類蛋白,在蘋果屬植物防御反應機制中的具體作用,為開展相關的基因組學和轉錄組學研究提供了重要參考。

由歐文氏細菌(Erwinia amylovora)侵染而引發(fā)的火疫病(fire blight),是蘋果及其他薔薇科植物的毀滅性病害,已成為影響蘋果、梨產業(yè)發(fā)展的重要病害之一[28]。目前,關于蘋果屬植物寄主與火疫病致病菌互作方面的研究,主要集中于病原菌致病機理,尤其是互作過程中效應蛋白(effector proteins)的分泌及其轉運途徑研究[2930],研究發(fā)現(xiàn),蘋果屬植物寄主應答火疫病菌侵染,主要依賴于自身抗性基因與致病菌效應因子的親和性或非親和性互作,包括病原菌致病相關的兩類效應蛋白(Dsp E和Hrp N)與蘋果寄主細胞抗病基因的互作,進而產生抗病或感病反應[31]。蘋果褐腐病(brown rot)是由鏈核盤菌(Monilinia laxa)侵染蘋果花、幼苗及嫩枝引起的真菌性病害,主要表現(xiàn)為果實成熟期落果,或采后貯存期腐爛[32]。為了探討褐腐病病菌對仁果類、核果類寄主的專一性,Bregar等[33]利用差異蛋白質組學方法,以從蘋果、杏發(fā)病果實上分離純化的褐腐病菌為研究試材,比較了兩種寄主分離菌的總蛋白削弱樹勢,影響果實產量和品質[34-35]。Li等[36]利用蛋白質雙向電泳結合MALDI-TOF-TOF質譜檢測,分析了‘秦冠’蘋果葉片經蘋果盤二孢菌(Marssonina coronaria)侵染前后的差異蛋白質表達情況。通過對35個差異蛋白質點的功能分析,系統(tǒng)分析了抗氧化相關、防御及脅迫反應相關蛋白的差異表達情況,并探討了其中的內切幾丁質酶-3(classⅢendo-chitinase, PR-3)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanases,PR-2)、類甜蛋白(thaumatin-like protein,PR-5)等3個病程相關蛋白與蘋果屬植物寄主抗病反應的相關性。

蘋果黑星病(apple scab)是世界性的真菌性病害,其致病菌Venturia inaequalis主要通過侵染蘋果枝條、果實而引起寄主大面積發(fā)病,成為蘋果產區(qū)的重要病害。Gau等[37]以易感病的蘋果栽培品種‘Elstar’為研究對象,通過SDS-PAGE結合2-DE技術,分析其葉片經黑星病菌(V.inaequalis)侵染前后,葉片細胞內非原質體蛋白的差異表達情況。進一步結合免疫印跡分析,證實葉片細胞應答黑星病菌侵染前后,非原質體內β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶、類甜蛋白等病程相關蛋白為關鍵的抗病相關蛋白。

蘋果斑點落葉病是目前我國蘋果主產區(qū)的主要病害之一。張彩霞等[38]以蘋果葉片與斑點落葉病菌(A.alternata apple pathotype)為研究對象,通過雙向電泳方法比較了病原菌脅迫過程中蘋果葉片總蛋白的差異表達情況,再經MALDI-TOF-TO質譜檢測及功能檢索,共獲得20個蛋白點的功能信息,探討了其中抗病反應相關的抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)以及蘋果過敏原Mal d1表達譜。通過對軟件分析獲得的50個差異蛋白點進行質譜檢測,共有41個蛋白點被成功鑒定,依據功能信息可劃分為蛋白質代謝、能量產生、糖代謝、脅迫反應、脂肪酸代謝及其他蛋白等6類。通過比較分析發(fā)現(xiàn),某些已經研究證實的毒性因子蛋白僅在蘋果分離菌株中有表達,然而,關于這些蛋白的寄主專一性機制仍不清楚。該研究共獲得10個僅在蘋果分離菌中特異表達的差異蛋白,其中乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)上調量達11倍,表明該蛋白有可能作為蘋果褐腐病寄主專一性的診斷標記。蘋果褐斑病(Marssonina apple blotch)也是蘋果生產中的主要病害之一,其致病菌蘋果褐斑病菌(Diplocarpon mali),主要通過侵染生長期的蘋果葉片、嫩枝、果實等引起寄主發(fā)病并大量落葉,進而蘋果葉片應答病原菌脅迫過程中的關鍵作用,為進一步開展蘋果抗病分子機制研究提供參考。

蘋果采后經常會受到各種生物、非生物脅迫,引起嚴重的經濟損失。Buron-Moles等[39]為了解蘋果果實應答各種脅迫的防御反應機制,研究了蘋果果實在機械損傷、病原菌侵染等條件下的氧化反應相關蛋白的差異表達。進一步通過質譜分析結合蛋白質羰基含量檢測,共獲得27個活性氧(ROS)代謝相關的差異表達蛋白,其中高豐度表達的ACC氧化酶及2個谷氨酰胺合成酶可能是影響蘋果果實應答機械損傷及病原菌脅迫的關鍵蛋白。

4 蛋白質組學分析技術在蘋果屬植物相關研究中存在的問題

當前,蛋白質組學分析技術仍存在許多技術上的缺陷,制約其大規(guī)模發(fā)展。例如,受分析檢測技術靈敏度的制約,基于2-DE分析的蘋果屬植物應答病原菌脅迫蛋白質組學研究中,雖然已經鑒定獲得大量差異蛋白點功能信息,仍有部分差異蛋白質點得不到成功鑒定,致使無法完整獲得寄主應答反應的分子機制。

此外,傳統(tǒng)2-DE分析中低豐度蛋白的獲得及蛋白質樣品的定量問題也是制約蘋果屬植物蛋白質組學研究的關鍵問題。近幾年發(fā)展的靈敏度較高的i TRAQ以及LC-MS/MS技術,在一定程度上解決了蛋白質樣品的定量問題。

蘋果基因組數據的公布[26],推動了蘋果屬植物蛋白質組學研究的迅速發(fā)展。然而,與模式植物相比,基因組數據庫中仍有大量的功能基因未得到成功驗證,進而限制了蘋果屬植物蛋白質組數據庫的完整性,因此,迫切需要開展大量基因功能研究,不斷補充和完善蘋果基因組數據庫。

5 小結與展望

總之,關于蘋果屬植物寄主應答病原菌脅迫過程的研究發(fā)現(xiàn),寄主可以通過啟動多個途徑來實現(xiàn)對病原菌脅迫的防御或響應,包括光合作用、能量代謝、脅迫及防御反應等相關蛋白的差異表達,其中病程相關的PR類蛋白在植物寄主應答病原菌脅迫過程中可能起到關鍵作用,還需要對這些蛋白進行深入的分析,如利用反向遺傳學策略(目標基因過表達或RNAi干涉技術)對關鍵目標蛋白進行功能分析,來明確調控蘋果寄主抗病相關的功能蛋白。

近年來,針對生物機體開展綜合性研究已成為一種趨勢,其中,高通量組學(omics)技術,包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學,以及傳統(tǒng)的生物化學、細胞生物學等學科技術的相互交叉、驗證,對于深入認識生命活動的內在機制具有重要意義[40]。

迄今為止,關于蘋果屬植物的蛋白質組學研究多集中于2-DE電泳,MALDI-TOF質譜分析,鑒于植物寄主應答病原菌侵染的復雜性,需要開展更加深入的研究,如參考模式植物上開展的蛋白質定位、蛋白質相互作用、蛋白質芯片、酵母雙雜交等技術,以系統(tǒng)認識蘋果屬植物應答病原菌脅迫時所啟動的抗性機制,充實果樹抗病的分子理論研究。

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(責任編輯：田 喆)

Progress in proteomics studies of the response of apple plants to their pathogens

Zhang Caixia, Tian Yi, Zhang Liyi, Xiao Long, Song Chengxiu, Cong Peihua

(Key Laboratory of Horticulture Crops Germplasm Resources Utilization,Ministry of Agriculture/Research Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xingcheng 125100,China)

Rapid development of apple genome research builds up an important basis for proteomics research of Malus spp.In recent years,proteomics approaches played a key role in exploring the differential expression of defense-related proteins induced by the pathogens,and understanding the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens.Based on the application of proteomics approaches on fruit trees,we review the apple proteomics studies,including the resistance-related proteins of apple host induced by some main diseases in apple production,such as fire blight,Marssonina apple blotch,and apple scab,which will provide some clues to a comprehensive understanding of the molecular mechanism of apple host resistance to the pathogens.

apple; pathogen; proteomics; progress

S 432.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.003

2014-12-08

2015-01-04

國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系(CARS-28);國家自然科學基金項目(30900968,31201602);國家科技支撐計劃項目(2013BAD02B01)

*通信作者 E-mail：congph@163.com