滇重樓的抗腫瘤活性成分研究

談文狀　陳軍　泰瑞清等

摘要：以活性追蹤手段尋找滇重樓中抗腫瘤活性成分，發(fā)現(xiàn)螺甾烷型甾體皂苷是其主要活性部位，進一步采用色譜方法純化得到10個化合物，經(jīng)波譜分析分別鑒定為：偏諾皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（1），薯蕷皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-β-D-葡萄吡喃糖苷（2），偏諾皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-β-D-葡萄吡喃糖苷（3），薯蕷皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-β-D-葡萄吡喃糖苷（4），偏諾皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（5），薯蕷皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（6），偏諾皂苷元-3-O-{α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]}-β-D-葡萄吡喃糖苷（7），偏諾皂苷元-3-O-α-L-木吡喃糖基（1→3）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（8），薯蕷皂苷元-3-O-{α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]}-β-D-葡萄吡喃糖苷（9），薯蕷皂苷元-3-O-α-L-葡萄吡喃糖基（1→3）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（10）.化合物8為首次從該屬植物中分離得到。

關(guān)鍵詞：滇重樓；抗腫瘤活性；皂苷

中圖分類號：R273文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2015）06-0091-05

【Abstract】 The track method was used to look for antitumor active ingredients of polyphylla growing in Yunnan. Spirostan steroidal saponins was found as the main active part. Chromatography was used to purify it to have obtained 10 compounds. After identified by spectral analysis， 10 compounds as follows， （1） partial promise saponins Yuan-3-O-β-D- glucopyranoside， （2） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （3） partial promise sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （4） diosgenin-3-O-α-L- mouse Lee pyranose group （1→2）-β-D- glucopyranoside， （5） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （6） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （7） partial Connaught sapogenin-3-O- {α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside， （8） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- wood pyranose group （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucose pyran glucoside， （9） diosgenin-3-O-{α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside，（10）diosgenin-3-O-α-L- grapes pyranosyl （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside. Compound 8 was first isolated from this genus.

【Key words】Yunnan polyphylla， antitumor activity， saponins

滇重樓[Paris polyphylla var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mezz]為百合科重樓屬植物的干燥根莖，在我國有著悠久的藥用歷史，以蚤休之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微寒，味苦；有小毒。具有清熱解毒、消腫散瘀、止血止痛之功效，在西南各省區(qū)種類和資源極為豐富[1]。民間用于治療癌癥的歷史非常悠久，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，重樓具有抗腫瘤、抑菌消炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止血等作用，其中甾體皂苷類是其主活性成分[2]。近年來，通過對滇重樓植物的化學(xué)成分分析，，已從中分離鑒定了 50 余種化合物，主要有C27甾體皂苷、C21 孕甾烷苷、甾醇及其苷、黃酮苷、β-蛻皮激素等，其中甾體皂苷44種，占總化合物的 80%以上，其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元[2～6]。以往文獻較多側(cè)重于化學(xué)成分方面的研究，而與藥理作用相結(jié)合以活性追蹤手段尋找活性成分的抗癌活性研究極少，本實驗采用此方法，明確了滇重樓中抗腫瘤活性成分為螺甾烷型甾體皂苷，并對其進行分離純化，得到10個活性化合物。

1實驗儀器與材料

1.1實驗儀器與材料1D-NMR和2D-NMR由Bruker DRX-600及 AM-400核磁共振儀（Bruker BioSpin group，Germany）測定。以氘代吡啶（pyridine-d5）為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移δ用ppm表示，耦合常數(shù)J用Hz表示；ESI-MS由Agilent 6530B質(zhì)譜儀（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA））測定。

HPLC分析在Agilent 1200型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA）上完成，分析柱為 Zorbax SB-C18（Agilent，4.6 × 250 mm）柱；中壓液相色譜（MPLC）為 BUCHI Labortechnik AG CH-9230（Flawil Switzerland）。

柱色譜使用的材料包括 100-200、200-300目硅膠（青島海洋化工廠）；ODS（YMC*Gel ODS-A，50 μm，YMC Co.，Ltd.，Japan）。TLC 采用G型和 GF254型預(yù)制硅膠板（青島海洋化工廠）。TLC 顯色劑為 10% H2SO4-EtOH溶液、茴香醛試劑（茴香醛/濃硫酸/乙醇=1：1：18，v/v）和Ehrlich 試劑，噴灑后適當(dāng)加熱顯色。

1.2實驗材料來源滇重樓根莖于2011年8月采自云南普洱糯扎渡，共 2.5 kg，由昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李海舟教授鑒定。樣品標(biāo)本現(xiàn)存放于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院中藥化學(xué)與中藥現(xiàn)代化實驗室，編號為201108009。

2實驗方法

2.1提取與分離滇重樓干燥根莖 2.5 kg，經(jīng)粉碎后用70%甲醇/水提取3次，每次24 h。合并提取液，減壓蒸餾至無甲醇味后，分別用氯仿和正丁醇進行萃取。氯仿部分量較少，放置。正丁醇部分（165 g）用Diaion HP-20 大孔樹脂進行粗劃段，用純水及30%，60%，90%，100%甲醇/水，依次洗脫得到單糖、多酚、呋甾和螺甾四個部分（Fr.1-Fr.4）。Fr.4（45 g）經(jīng)硅膠柱層析（氯仿/甲醇，20：1-1：1）及ODS-A反相柱層析（中壓制備色譜，10%-100%甲醇/水，梯度洗脫）反復(fù)交替分離純化得到化合物1（4.2 mg）、化合物2（2.1 mg）、化合物3（3.3 mg）、化合物4（7.6 mg）、化合物5（17.7 mg）、化合物6（4.1 mg）、化合物7（2.2 mg）、化合物8（1.5mg）、化合物9（17.1 mg）和化合物10（17.0 mg）。

2.2滇重樓各提取相及粗劃段各部分抗腫瘤作用（1）取對數(shù)生長期的人宮頸癌HeLa 細(xì)胞，用含 10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基配制成 5×104/ mL 的細(xì)胞懸液，按每孔 100 μL 接種于 96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h。（2）經(jīng)過24h培養(yǎng)后，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，在細(xì)胞生長良好的情況下，分別將7個待測樣品和對照品溶液加入96孔板中，每個濃度隨機設(shè)置4個復(fù)孔，每孔加入量為1μL，陽性對照組為紫杉醇（10 μM/mL），每孔加入 100 μL培養(yǎng)基，再將96 孔板在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。（3）培養(yǎng)72 h后，小心吸去上清液，每孔加入以無血清培養(yǎng)液新鮮配制的 1 mg/ mL MTT 20 μL，37 ℃ 溫育 4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，在 490nm 處測定吸光度（A）值。取4孔平均值，按公式：細(xì)胞增殖抑制率=[（1-加藥細(xì)胞 A 值/對照細(xì)胞 A 值）×100%]，計算每個質(zhì)量濃度下的細(xì)胞增殖抑制率。

3實驗結(jié)果

3.1滇重樓各提取相及粗劃段各部分抗腫瘤作用，見表1。

4結(jié)論

MTT法活性篩選（表1）提示滇重樓的甲醇提取物和其正丁醇萃取相對HeLa腫瘤細(xì)胞有較強的抑制作用，氯仿萃取相只在較高的濃度下有一定生物活性，且氯仿相量非常少，說明不是滇重樓的抗腫瘤活性部位。對表現(xiàn)出較強活性的正丁醇部分在經(jīng)Diaion HP-20 粗劃段得到的四部分，其中Fr.1 H2SO4-EtOH溶液顯灰黑色，茴香醛試劑和Ehrlich 試劑均不顯色，Molish呈陽性反應(yīng)，綜上推斷Fr.1為糖類，可能提供細(xì)胞生長的物質(zhì)，促進HeLa腫瘤細(xì)胞生長。Fr.2 FeCl3試劑顯色，呈陽性，推測為多酚，對腫瘤細(xì)胞有較弱的抑制增殖活性。Fr.3茴香醛試劑和Ehrlich 試劑均顯色，表明為呋喃甾烷類甾體皂苷，有一定抑制增殖活性。Fr.4茴香醛試劑顯色，而Ehrlich 試劑不顯色，故為螺甾烷型甾體皂苷，抑制HeLa腫瘤細(xì)胞增殖活性最高，是滇重樓抗腫瘤的主要活性部位，從中得到10個化合物，均為螺甾烷型甾體皂苷，其皂苷元只有薯蕷皂苷元和諞諾皂苷元兩種，而3位糖鏈的構(gòu)成不一樣，包括單糖到4糖組成，其中化合物8 為首次從該植物中分離得到。本研究結(jié)果果較明確地闡述了滇重樓抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-04-10）