柴胡配伍解毒化濁藥對(duì)乳腺癌引經(jīng)增效的實(shí)驗(yàn)研究

胡升芳　陳紅風(fēng)　谷煥鵬等

摘要：目的通過(guò)觀察柴胡配伍解毒化濁藥對(duì)乳腺癌的作用，探尋柴胡引經(jīng)增效的機(jī)制，為中醫(yī)中藥抗乳腺癌肝轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：引經(jīng)中藥的藥物血清干預(yù)SK-BR-3 人乳腺癌細(xì)胞株，觀察中藥對(duì)SK-BR-3細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。體外實(shí)驗(yàn)：40只BALB/c雌性裸小鼠背部右側(cè)皮下接種人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞，7 d后隨機(jī)分3組，引經(jīng)中藥組，中藥組，生理鹽水組，給藥21天后稱取各組裸鼠體重、瘤重、計(jì)算腫瘤抑制率，觀察裸鼠肝脾組織病理HE染色。結(jié)果引經(jīng)中藥組阻止SK-BR-3細(xì)胞周期的G2/M期，抑制細(xì)胞的有絲分裂，減少G0/G1期細(xì)胞數(shù)量。高劑量引經(jīng)中藥組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯，與生理鹽水組比較有顯著性差異，P<0.05。引經(jīng)中藥組抑瘤率為56.21%，中藥可明顯降低腫瘤和脾重量，與生理鹽水組比均有顯著性差異，P<0.05。3組肝臟重量無(wú)明顯變化，生理鹽水組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論柴胡通過(guò)阻止SK-BR-3細(xì)胞周期抑制增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。柴胡能引解毒化濁藥入肝脾對(duì)接種人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞的裸小鼠的肝脾病變起引經(jīng)增效作用。

關(guān)鍵詞：引經(jīng)藥；柴胡；HER-2陽(yáng)性；乳腺癌；肝轉(zhuǎn)移

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2015）06-0083-03

中國(guó)癌癥研究基金會(huì)調(diào)查研究表明，乳腺癌已經(jīng)成為對(duì)女性威脅最大的惡性腫瘤。乳腺癌肝轉(zhuǎn)移因缺乏明確的靶向性，對(duì)化療反應(yīng)差，是影響乳腺癌預(yù)后較重要的因素。HER-2陽(yáng)性乳腺癌因其生存率低、惡性程度高、易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[1]，以研究乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制及治療方法評(píng)估一直是乳腺癌動(dòng)物模型研究的重點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤藥物靶向與中醫(yī)歸經(jīng)（引經(jīng)）理論有相似性[2]，總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)[3-6]，發(fā)現(xiàn)引經(jīng)藥柴胡對(duì)抗腫瘤中藥有協(xié)同作用，本研究通過(guò)觀察引經(jīng)中藥柴胡與解毒化濁藥物協(xié)同對(duì)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的影響，探尋中藥歸經(jīng)與作用靶點(diǎn)的關(guān)系，為合理選擇抑癌中藥提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所，MDA-MB-435人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C雌性裸小鼠，SPF級(jí)，體重20 g±2 g，4-6周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2藥物及試劑中藥組方（解毒化濁藥）：黃芪、白術(shù)、茯苓、蚤休、蛇六谷、半枝蓮、石上柏：引經(jīng)中藥組方：柴胡配伍解毒化濁藥。以上中藥飲片均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬門診部中藥房提供。RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；Annexin V/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備CO2培養(yǎng)箱（伯樂公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺(tái)（蘇凈），BECKMAN 流式細(xì)胞儀（BECKMAN公司），勻漿機(jī)，熒光定量PCR儀，超低溫冰箱，微量核酸測(cè)定儀，冷凍高速離心機(jī)（BECKMAN公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1中藥含藥血清的制備雌性Wistar大鼠10只，體重（180±20）g，隨機(jī)分組5組，每組2只。實(shí)驗(yàn)共分5組：中藥低劑量組、引經(jīng)中藥低劑量組、中藥高劑量組、引經(jīng)中藥高劑量組、生理鹽水組。中藥低劑量組2.68 g/kg/d，灌胃，每天1次，每次2 mL；引經(jīng)中藥低劑量組、2.83 g/kg/d，每次2 mL；中藥高劑量5.36 g/kg/d，灌胃每天1次，每次2 mL；引經(jīng)中藥高劑量組5.66 g/kg/d，每次2 mL；生理鹽水組給等量生理鹽水，灌胃，每天1次，每次2 mL，連續(xù)4天取動(dòng)物血清。

2.2裸鼠移植瘤模型建立及分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-435細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞2遍，離心，用無(wú)血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107 /mL，每只BALB/c 裸鼠用1 mL注射器接種200 μL細(xì)胞懸液于其背部右側(cè)皮下。細(xì)胞接種7d后，測(cè)量腫瘤隨機(jī)分組。本實(shí)驗(yàn)共分3組：中藥組、引經(jīng)中藥組、生理鹽水組。中藥組，每只裸鼠灌胃每天兩次，每次0.3 mL；引經(jīng)中藥組，灌胃每天兩次，每次0.3 mL；生理鹽水組給等量生理鹽水，灌胃每天早晚兩次，每次0.3 mL。給藥時(shí)間均為21 d。

2.3標(biāo)本取材用藥后第21 d，將小鼠脫頸處死，取腫瘤瘤塊、肝和脾臟，分別稱重。將肝組織分別放入10%中性甲醛固定，做HE染色。

3觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)方法

3.1引經(jīng)中藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響AnnexinV-FITC/PI法細(xì)胞凋亡分析，將含藥血清作用24 h及未加藥處理的SK-BR-3 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，將待測(cè)細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，離心10 min，棄上清液，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于binding buffer300 μL，加入Annexin V-FITC 10 μL，輕輕搖勻，室溫反應(yīng)，加入PI5 μL輕輕搖勻，室溫反應(yīng)15 min，細(xì)胞經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。分析細(xì)胞凋亡率。

3.2引經(jīng)中藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞周期的影響將含藥血清作用細(xì)胞及未加藥處理的SK-BR-3 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，將待測(cè)細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，離心10 min，棄上清液，95%乙醇固定，上機(jī)前用PBS清洗1次，轉(zhuǎn)速1500轉(zhuǎn)/min，5 min，棄上清液。加1%曲通（Tritonx-100）1mL，室溫下靜置10 min，離心，棄上清液，加PBS清洗1次，加0.01% RNASE酶1 mL，37度水浴恒溫箱振蕩10 min，離心，棄上清液，加0.05%碘化丙啶1 mL染色，用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，存放在4度冰箱內(nèi)，20 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.3測(cè)量裸鼠瘤重、脾重及計(jì)算腫瘤抑制率觀察各組小鼠腫瘤出現(xiàn)速度及生長(zhǎng)情況，稱取各組小鼠瘤重、脾重及計(jì)算腫瘤抑制率：抑瘤率=（對(duì)照組瘤重-治療組瘤重）/對(duì)照組瘤重。

3.4觀察裸鼠肝組織病理HE染色石蠟切片制作：肝臟組織0.6×0.6cm→10%中性福爾馬林固定（24h）→酒精脫水→二甲苯1h→浸蠟3h→包埋→切片→烘干。HE染色：蘇木素15 min，水洗，1%分化液3秒水洗20 min，伊紅3 min，無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，封片。

3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異有顯著性意義的數(shù)值.

4結(jié)果

4.1引經(jīng)中藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞周期24 h、48 h的影響觀察各組藥物對(duì)細(xì)胞周期24h的影響發(fā)現(xiàn)，引經(jīng)中藥組主要阻止細(xì)胞于G2/M期，抑制細(xì)胞的有絲分裂，減少G0/G1期細(xì)胞數(shù)量。觀察各組藥物對(duì)細(xì)胞周期48h的影響發(fā)現(xiàn)，中藥組及引經(jīng)中藥組主要阻止細(xì)胞于G2/M期，抑制細(xì)胞的有絲分裂，減少G0/G1期細(xì)胞數(shù)量。見表1，表2

5討論

目前乳腺癌嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率已居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致最終治療失敗的主要原因。臨床上陸德銘教授根據(jù)中醫(yī)歸經(jīng)引經(jīng)理論和辨證論治原則，結(jié)合現(xiàn)代腫瘤多靶向治療觀點(diǎn)，治療乳腺癌患者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移有獨(dú)創(chuàng)的見解。

陸德銘教授認(rèn)為在十二經(jīng)絡(luò)中女子“乳頭屬肝，乳房屬胃”，即肝胃兩經(jīng)，肝主疏泄與藏血，情緒過(guò)激，肝火過(guò)旺，沖脈與任脈就虛弱，乳房得不到應(yīng)有滋養(yǎng)，氣滯血瘀，久則聚痰釀毒，凝結(jié)御乳中成巖。乳絡(luò)是乳房的經(jīng)絡(luò)歸屬，即中醫(yī)所講的“歸經(jīng)”。藥有引經(jīng)專長(zhǎng)的思想最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后張潔古在《醫(yī)學(xué)啟源》云：“柴胡，少陽(yáng)、厥陰引經(jīng)藥也”，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂柴胡“主心腹腸胃中結(jié)氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”。柴胡不但具有疏肝樞轉(zhuǎn)少陽(yáng)之功，而且能疏通三焦和胃，治療乳腺癌患者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移時(shí)，陸教授加入柴胡引經(jīng)藥物，通過(guò)經(jīng)絡(luò)髓道直達(dá)病所，可起到腫消，痛止，瘀散，堅(jiān)化之作用?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為中醫(yī)的歸經(jīng)理論與現(xiàn)代腫瘤靶向治療觀點(diǎn)極為相似。治療時(shí)加入引經(jīng)藥物，將直接增強(qiáng)治療藥物在靶器官的濃聚，降低不良反應(yīng)，增加治療效果。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為抑制增殖和或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制之一，細(xì)胞周期是指細(xì)胞從DNA合成前期開始到有絲分裂完成的整個(gè)過(guò)程，抗腫瘤藥物對(duì)各期細(xì)胞的敏感性不同，中藥抗癌也可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期而起作用。從引經(jīng)中藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞周期的影響觀察到，高劑量引經(jīng)中藥組主要是使細(xì)胞阻止于G2/M期，抑制細(xì)胞的有絲分裂，減少G0/G1期細(xì)胞數(shù)量，而且增加作用腫瘤細(xì)胞時(shí)間，能明顯增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的影響。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，引經(jīng)中藥通過(guò)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞周期改變的影響細(xì)胞的增殖。

中藥對(duì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)凋亡作用，高劑量引經(jīng)中藥組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用較明顯，用藥組凋亡率隨濃度加大和加入引經(jīng)中藥柴胡后，有增大凋亡趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引經(jīng)中藥能增強(qiáng)中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

體外實(shí)驗(yàn)觀察引經(jīng)中藥對(duì)裸鼠腫瘤的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引經(jīng)中藥組可以明顯降低腫瘤重量，抑瘤率為56.21%。通過(guò)肝臟的病理變化發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組肝細(xì)胞壞死，肝索排列紊亂，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而中藥組、中藥引經(jīng)組裸鼠未見肝細(xì)胞壞死，肝索排列相對(duì)于生理鹽水組整齊，引經(jīng)中藥不但能增強(qiáng)中藥的抗癌效果，而且能引經(jīng)入肝，對(duì)肝起保護(hù)作用。本次實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較長(zhǎng)，雖觀察到生理鹽水組出現(xiàn)肝壞死，證實(shí)了柴胡的引經(jīng)增效作用，但未能觀察到生理鹽水組出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，尚不能驗(yàn)證中藥治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的確切療效，對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的一些尚不明確的結(jié)果，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型設(shè)計(jì)上還存在局限性有關(guān)，進(jìn)一步的研究可考慮選用HER-2轉(zhuǎn)基因小鼠提高誘發(fā)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移率，更好觀察中藥治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jia WJ，Jia HX，F(xiàn)eng HY，et al.HER2-enriched Tumors Have the Highest Risk of Local Recurrence in Chinese Patients Treated with Breast Conservation Therapy[J].Asian Pac J Cancer Prev.2014，15（1）：315-20.

[2]趙瑞芝，劉少軍.中藥引經(jīng)理論與靶向給藥[J].中醫(yī)雜志，2005，46（9）：643.

[3]胡升芳.陸德銘教授治療HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌術(shù)后經(jīng)驗(yàn)研究[C].陸德銘治療乳房疾病學(xué)術(shù)思想和臨證經(jīng)驗(yàn)研討會(huì)論文集.2013，57-60.

[4]胡升芳，陳紅風(fēng)，陸德銘.HER-2過(guò)表達(dá)乳腺癌治療研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（3）：560-562.

[5]胡升芳.陸德銘教授治療乳腺疾病學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)及HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌術(shù)后診療規(guī)律研究[D].上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[6]胡升芳，陳紅風(fēng)，秦悅農(nóng)，等.乳寧Ⅱ號(hào)方防治乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移臨床療效評(píng)價(jià)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（11）：2396-2398.

（收稿日期：2015-03-04）