結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)塵肺結(jié)核的診斷價(jià)值

李林陽(yáng)，廖江榮

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)塵肺結(jié)核的診斷價(jià)值

李林陽(yáng)，廖江榮

塵肺；結(jié)核

塵肺是由于在職業(yè)活動(dòng)中長(zhǎng)期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病，是我國(guó)現(xiàn)階段最主要、最嚴(yán)重的職業(yè)病病種[1-2]。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，是塵肺常見(jiàn)的嚴(yán)重合并癥。臨床上把這兩種病變復(fù)合共存的特殊類型單列為塵肺結(jié)核[3]。塵肺結(jié)核患者體內(nèi)的矽塵與結(jié)核菌協(xié)同作用引起復(fù)雜的組織反應(yīng)，使其病理改變、臨床表現(xiàn)與影像學(xué)特點(diǎn)均不同于單純的塵肺或結(jié)核[4]。塵肺結(jié)核在臨床上常被漏診或誤診。傳統(tǒng)的結(jié)核病輔助診斷方法如痰涂片抗酸染色(AFB)、結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)、結(jié)核抗體檢測(cè)等均存在敏感性或特異性方面的不足，而“結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)”作為診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性雖高但敏感性低，且培養(yǎng)時(shí)間一般為2～8周。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種診斷結(jié)核性疾病的新方法[5]。本研究將T-SPOT.TB與PPD試驗(yàn)、TB-Ab檢測(cè)、痰A(chǔ)FB等方法進(jìn)行比較，探討其在塵肺結(jié)核診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2014年4月－2015年2月入住我院呼吸科、臨床診斷疑似塵肺結(jié)核(SCTB)的患者為研究對(duì)象。所有患者均進(jìn)行詳細(xì)病史采集，并平行進(jìn)行T-SPOT.TB、TB-Ab、AFB、TST等檢測(cè)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及隨訪后最終診斷，將疑似病例分為塵肺結(jié)核組與塵肺組。塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ70-2009)，由專門的塵肺病診斷專家小組進(jìn)行確診，并發(fā)放塵肺病鑒定證書。塵肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷：①有結(jié)核接觸病史，近期出現(xiàn)低熱、盜汗、乏力、消瘦等結(jié)核中毒表現(xiàn)；②合并有結(jié)核性胸膜炎；③高千伏X線提示：肺尖或鎖骨下出現(xiàn)不對(duì)稱小片狀或斑片狀密度不均陰影，或上肺野迅速出現(xiàn)浸潤(rùn)病灶；動(dòng)態(tài)胸片可見(jiàn)原已確診為塵肺的融合團(tuán)塊短期多變，形成形態(tài)不規(guī)則的較大空洞，伴同側(cè)或?qū)?cè)播散者病變進(jìn)展快，毀損、破壞等改變嚴(yán)重；④常規(guī)抗感染治療2周無(wú)效，經(jīng)抗結(jié)核治療后好轉(zhuǎn)，跟蹤隨訪半年，胸片提示病灶明顯吸收，最終確診；(2)實(shí)驗(yàn)室檢查：痰、支氣管鏡刷片、灌洗液結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性，病理檢查可見(jiàn)結(jié)核典型改變(如干酪樣壞死)?；颊逪IV抗體均呈陰性，近期無(wú)嚴(yán)重病毒感染史，無(wú)嚴(yán)重肝腎衰竭，近期無(wú)輸血及PET-CT檢測(cè)，無(wú)免疫抑制劑用藥史及放化療治療。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目

1.3.1 AFB檢測(cè)及結(jié)果判定 按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 PPD試驗(yàn) 所有入選患者左前臂曲側(cè)中上部1/3處皮下注射5U(0.1ml)人型純蛋白衍生物(purified prote in derivatives，PPD)試劑，實(shí)驗(yàn)后48～72h觀察并記錄結(jié)果，硬結(jié)直徑≥5mm判定為陽(yáng)性。

1.3.3 結(jié)核抗體檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 T-SPOT.TB檢測(cè) (1)操作步驟：①采集肝素鋰抗凝的外周血5ml行外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離，采用全血模式進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，配制成終濃度為25萬(wàn)個(gè)單個(gè)核細(xì)胞/100μl的細(xì)胞懸液。②在每個(gè)樣本的板條上按順序設(shè)置陰性對(duì)照、抗原A(早期分泌性靶抗原6，ESAT-6)、抗原B(濾液培養(yǎng)蛋白10，CFP-10)、陽(yáng)性對(duì)照，再按上述順序，在4個(gè)孔中分別加入已制備好的終濃度細(xì)胞懸液100μl，將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20h，PBS洗4次。③每孔加入50μl新鮮配制的酶標(biāo)二抗工作液，2～8℃孵育1h，PBS洗4次。④每孔加入50μl顯色液，避光顯色7～12min，蒸餾水終止顯色3～4次，使用濾紙拍板，自然干燥后進(jìn)行結(jié)果判讀，干燥后的板條可在干燥避光條件下長(zhǎng)期保存。(2)結(jié)果判讀：①陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，且(抗原A孔或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù))－(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6，為“陽(yáng)性”；②陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)，且(抗原A孔或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù))≥2×(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))，為“陽(yáng)性”；③如不符合上述標(biāo)準(zhǔn)，且陽(yáng)性對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為“陰性”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算靈敏度、特異度、假陽(yáng)性率、假陰性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比、Youden指數(shù)等，使用U檢驗(yàn)比較不同檢測(cè)方法靈敏度、特異度等診斷效果評(píng)價(jià)指標(biāo)的差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

共納入疑似塵肺結(jié)核患者94例，其中男66例，女28例，年齡21～79(48.6)歲。塵肺結(jié)核65例，男43例，女22例，年齡26～79(50.2)歲。支氣管肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌者8例，支氣管刷檢檢出抗酸桿菌者6例，痰涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌者4例，經(jīng)皮肺活檢組織病理證實(shí)為結(jié)核病者5例，抗結(jié)核治療后臨床癥狀明顯改善且胸片顯示病灶明顯吸收者42例。塵肺29例，男23例，女6例，年齡21～73(48.9)歲，均符合SC診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)抗感染治療后胸片提示病灶吸收。

4種檢測(cè)方法對(duì)肺結(jié)核的單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，診斷效果見(jiàn)表2。T-SPOT.TB檢測(cè)肺結(jié)核的靈敏度顯著高于TB-Ab、PPD試驗(yàn)和AFB(u=4.925，P<0.001；u=6.156，P<0.001；u=11.637，P<0.001)。T-SPOT.TB檢測(cè)肺結(jié)核的特異度顯著高于PPD試驗(yàn)(u=2.169，P<0.05)，T-SPOT.TB的特異度與TB-Ab、AFB比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=1.867，P>0.05；u=1.466，P>0.05)。T-SPOT.TB檢測(cè)肺結(jié)核的Youden指數(shù)顯著高于TB-Ab、PPD 和AFB(u=4.306，P<0.001；u=5.130，P<0.001；u=8.218，P<0.001)。T-SPOT.TB對(duì)肺結(jié)核的檢出效果明顯優(yōu)于TB-Ab、PPD試驗(yàn)和AFB。

表1 4種檢測(cè)方法結(jié)果比較Tab.1 Comparison of the results of 4 test methods

表2 4種檢測(cè)方法診斷效果比較Tab.2 Comparison of the diagnostic effects of 4 test methods

3 討 論

塵肺患者肺內(nèi)沉積著大量難溶性矽塵，使肺部毛細(xì)血管床和淋巴系統(tǒng)嚴(yán)重受損，肺纖維化破壞了大批巨噬細(xì)胞，削弱了巨噬細(xì)胞吞噬、消化、殺菌的能力。同時(shí)結(jié)核免疫的效應(yīng)細(xì)胞也受到影響，使入侵的結(jié)核菌不能被及時(shí)消滅而繼續(xù)繁殖、生長(zhǎng)、播散，阻礙了結(jié)核獲得性免疫的建立，因此塵肺患者易于合并肺結(jié)核。已知塵肺結(jié)核可促進(jìn)塵肺病發(fā)展，塵肺又可促進(jìn)結(jié)核病病情惡化，使塵肺結(jié)核的死亡發(fā)生率顯著增高[6]。因此，盡早確診塵肺結(jié)核對(duì)降低患者病死率、延長(zhǎng)塵肺患者生命具有重要意義。

PPD是從結(jié)核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，含有超過(guò)200種抗原成分，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗(bacillus calmette-gurin，BCG)的共同抗原成分，易發(fā)生交叉反應(yīng)，造成較高“假陽(yáng)性”率。其次，TST對(duì)于感染結(jié)核菌2周之內(nèi)、近期免疫受抑制者、重癥患者、年幼兒童及營(yíng)養(yǎng)不良、器官移植者缺乏足夠靈敏度。本研究PPD試驗(yàn)敏感性為58.5%，特異性為72.4%。Meta分析指出PPD試驗(yàn)的診斷敏感性為78.7%～81.6%，特異性為52.4%～57.9%[7]。與本研究數(shù)據(jù)差異較大，主要可能是塵肺患者免疫功能低、全身反應(yīng)弱所致。本研究T-SPOT.TB敏感性為96.9%，特異性為93.1%，與Cho等[8]及高愛(ài)忠等[9-11]的研究結(jié)果相近。Piana等[12]認(rèn)為T-SPOT.TB在免疫抑制患者中有穩(wěn)定的靈敏度和性能。本研究中T-SPOT.TB假陰性率僅為3.08%，而PPD試驗(yàn)假陰性率41.54%，也說(shuō)明T-SPOT.TB檢測(cè)穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確率高，受免疫功能影響小。

血清TB-Ab是由機(jī)體感染結(jié)核桿菌后針對(duì)結(jié)核菌素混合抗原所產(chǎn)生的一組免疫球蛋白。一項(xiàng)Meta分析顯示，抗結(jié)核抗體檢查具有較大的不穩(wěn)定性，各種測(cè)試之間差異較大[13]。儲(chǔ)新民等[14]報(bào)道TB-Ab對(duì)結(jié)核類疾病診斷的敏感性和特異性都遠(yuǎn)低于T-SPOT.TB等其他結(jié)核檢測(cè)方法。本研究中結(jié)核抗體敏感性66.2%，特異性75.9%，均低于本研究中T-SPOT.TB的敏感性(96.9%)及特異性(93.1%)。

盡管痰涂片抗酸染色簡(jiǎn)便、快捷，特異性高，但敏感性較低。大量資料顯示，當(dāng)痰液中分枝桿菌含量為(1000～10 000)/ml時(shí)，其痰涂片陽(yáng)性率為40%～50%，表明大量涂陰結(jié)核患者未檢出，漏診率較高。本研究中抗酸桿菌試驗(yàn)敏感性為27.7%，與敏感性為93.1%的T-SPOT.TB比較不具優(yōu)勢(shì)。

T-SPOT.TB結(jié)合了酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(即ELISPOT技術(shù))與γ-干擾素釋放試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)受結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應(yīng)T細(xì)胞來(lái)診斷結(jié)核感染。結(jié)核感染后體內(nèi)長(zhǎng)期存在抗原特異性T細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。本實(shí)驗(yàn)利用ESAT6和CFP10兩種結(jié)核特異性抗原刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素，通過(guò)ELISPOT方法檢測(cè)γ-干擾素的釋放水平(即斑點(diǎn)多少)，從而判斷機(jī)體是否感染結(jié)核桿菌。ESAT6和CFP10均來(lái)自結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)域，且僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群存在RD1區(qū)，因此，該檢測(cè)不受卡介苗接種、環(huán)境分枝桿菌感染的影響，特異性強(qiáng)，是目前早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病最有效的檢測(cè)手段。本研究中T-SPOT.TB敏感性96.92%，特異性93.10%，與文獻(xiàn)報(bào)告相近[8-11]，高于PPD試驗(yàn)、AFP及TB-Ab檢測(cè)。Meier等[15]認(rèn)為血T-SPOT.TB高陰性預(yù)測(cè)值對(duì)于排除結(jié)核病有重要價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)告免疫抑制狀態(tài)也不影響T-SPOT.TB敏感性，適用于免疫低下、接受免疫抑制劑治療患者結(jié)核感染的檢測(cè)[16]。本研究T-SPOT.TB假陽(yáng)性率為6.9%，低于PPD試驗(yàn)(27.6%)和TB-Ab(24.1%)，盡管AFP假陽(yáng)性率為0，但敏感性遠(yuǎn)低于T-SPOT.TB。T-SPOT.TB假陰性率3.1%，低于PPD試驗(yàn)(41.5%)、結(jié)核抗體檢測(cè)(33.8%)和AFP(72.3%)。

綜上所述，T-SPOT.TB對(duì)診斷塵肺結(jié)核顯示出較好的敏感性、特異性，且假陽(yáng)性率、假陰性率較低，有臨床診斷價(jià)值。但T-SPOT.TB檢測(cè)尚不能完全鑒別診斷潛伏性結(jié)核感染與活動(dòng)性結(jié)核感染，這在結(jié)核發(fā)病率高，潛伏性結(jié)核多的我國(guó)，削弱了T-SPOT.TB診斷活動(dòng)性結(jié)核感染的特異性。盡管如此，T-SPOT.TB還是展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。

[1]The ministry of heslth said the occupational-disease-prevention work situation in 2010 and 2011, the key work. http://www. moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/ s5854/201105/51676.htm.[衛(wèi)生部通報(bào)2010年職業(yè)病防治工作情況和2011年重點(diǎn)工作.]

[2]Ma L, Chen YL. 130 cases of coal workers' pneumoconiosis lung function analysis[J]. Chin J Pract Intern Med, 2013, 33(S1): 66-67. [馬蘭, 陳彥龍. 130例煤工塵肺肺功能分析[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2013, 33(S1): 66-67.]

[3]Deng XJ, Shuai JX. Summary of pneumoconiosis tuberculosis[J]. Chin J Coal Ind Med, 2007, 10(10): 1121-1123. [鄧小娟, 衰聚祥. 塵肺結(jié)核概述[J]. 中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 10(10): 1121-1123.]

[4]Lu C. Pneumoconiosis is empty, pneumoconiosis tuberculosis cavity with tuberculosis cavity imaging analysis[J]. China Prac Med, 2009, 4(32): 64-65. [陸聰. 塵肺空洞、塵肺結(jié)核空洞與肺結(jié)核空洞的影像學(xué)分析[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2009, 4(32): 64-65.]

[5]Liang DM, Liu DL, Wu XP,et al. Diagnostic value of T-SPOT. TB in intestinal tuberculosis[J]. Chin J Pract Intern Med, 2014, 34(11): 1106-1108. [梁瓞綿, 劉德良, 吳小平, 等. 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷腸結(jié)核價(jià)值研究[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2014, 34(11): 1106-1108.]

[6]Huang DH, Zhang SC, Ma JS. Clinical and imaging analysis on 377 cases of pneumoconiosis and pulmonary tuberculosis[J]. Occup Health, 2010, 26(3): 267-268. [黃登花, 張守才, 馬建設(shè). 塵肺合并肺結(jié)核377例臨床和影像學(xué)分析[J]. 職業(yè)與健康, 2010, 26(3): 267-268.]

[7]Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research[J]. Ann Intern Med, 2007, 146(5): 340-354.

[8]Cho OH, Park KH, Park SJ,et al. Rapid diagnosis of tubercμlous peritonitis by T cell-based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells[J]. J Infect, 2011, 62(6): 462-471.

[9]Gao AZ. Comparative assay of T-SPOT.TB and PPD in the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Pulmonary Med, 2015, 20(3): 432-434. [高愛(ài)忠. 兩種試驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷價(jià)值的比較[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(3): 432-434.]

[10] Liu Y. The diagnostic value of T-SPOT.TB in tuberculosis[J]. Contemp Med, 2013, 19(8): 12-13.[劉艷．T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病中的診斷價(jià)值[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2013, 19(8): 12-13.]

[11] Rong LX, Ma SH, Ai Q,et al. T. SPOT-TB test with PPD test for TB diagnosis value relevance[J]. Chin J Lab Diagn, 2013, 17(8): 1475-1476. [榮蘭香, 馬淑紅, 艾清, 等. T. SPOT-TB試驗(yàn)與PPD試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病患者診斷價(jià)值相關(guān)性比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2013, 17(8): 1475-1476.]

[12] Piana F, Codecasa LR, Cavallerio P,et al. Use of a T-cell-based test for detection of tuberculosis infection among immunocompromised patients[J]. Eur Respir J, 2006, 28: 31-34.

[13] Steingart KR, Henry M, Laal S,et al. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review[J]. PLoS Med, 2007, 4(6): e202.

[14] Chu XM, Kong JX. Sensitivity and specificity of T-SPOT.TB in diagnosing tuberculosis infection[J]. Acta Univ Med Anhui, 2012, 47(5): 613-615. [儲(chǔ)新民, 孔建新. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核的敏感性和特異性研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(5): 613-615.]

[15] Meier T, Eulenbruch HP, Wrighton-Smith P,et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay (T SPOTTB) for diagnosis of tuberculosis in clinical practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis[J]. 2005, 24(8): 529-536.

[16] Kim SH, Song KH, Choi SJ,et al. Diagnostic usefulness of a T-Cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocom-Promised patientis[J]. Am J Med, 2009, 122(2): 189-195.

R598

A

0577-7402(2015)08-0683-03

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.17

2015-03-14；

2014-06-29)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

遵義市科技局資助項(xiàng)目(201329)

563000 貴州遵義 貴州航天醫(yī)院肺科(李林陽(yáng)、廖江榮)

廖江榮，E-mail: ljr3409@sina.com